葡萄抗病相关基因表达及抗黑痘病转录组研究

发布时间：2017-11-22 19:29

  本文关键词：葡萄抗病相关基因表达及抗黑痘病转录组研究

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【摘要】：葡萄(Vitis vinifera L.)是重要的经济水果之一,具有很高的生态和社会价值,而真菌性病害如葡萄黑痘病(Elsinoe ampelina(de Bary)Shear)等严重影响着葡萄的产量和品质。许多理论和实践证明,利用葡萄自身抗病资源,培育抗病新品种是控制葡萄真菌病害最经济、有效的措施。我国野生葡萄材料中蕴藏着相当丰富的抗病资源,其中毛葡萄(V.quinquangularis)商-24株系对多种葡萄病害均表现高抗性,但其抗病的分子机理尚不明确。本研究首先对病原菌诱导下中国野生毛葡萄商-24株系的抑制消减杂交文库进行了抗病相关基因的筛选和表达分析;其次通过RNA-Seq技术对比分析了黑痘菌诱导下抗病毛葡萄商-24株系和感病欧亚种葡萄红地球在转录水平上的变化和差异,构建了葡萄应答黑痘菌胁迫的表达谱,筛选出了两个抗病相关的转录因子家族JASMONATE ZIM-DOMAIN(JAZ)家族和basic helix-loop-helix(bHLH)家族,对其进行生物信息学分析和不同处理下的基因表达研究,取得如下主要结果:1、对课题组前期构建的黑痘病和白粉病诱导的中国野生毛葡萄商-24株系SSH文库进行分析,从中筛选出183个葡萄抗黑痘病和87个抗白粉病相关基因,并对筛选出的20个葡萄抗黑痘病和13个抗白粉病相关候选基因进行实时定量表达分析,包括8个代谢相关基因、2个转录因子、2个信号转导基因、1个运输相关基因、9个防御相关基因和7个泛素化途径相关基因以及4个未知功能基因。结果显示,多数基因在抗病毛葡萄商-24株系中受病原菌诱导表现为上调表达,但在感病葡萄中表达量变化不明显,表明这些基因可能参与葡萄对病原菌胁迫的响应。2、分别以抗葡萄黑痘病的毛葡萄商-24株系和感黑痘病的欧亚种葡萄红地球叶片为材料,对接种葡萄黑痘病菌6 h、12 h、24 h、48 h和72 h 5个时间点的叶片及相应的清水处理叶片进行转录组测序。40份葡萄材料测序共获得高质量reads约346 M,每份材料与参考基因组的比对率均在80%左右;采用RPKM法计算每个基因在各个样本中的差异表达情况,共获得差异表达基因3414个,来自抗病毛葡萄商-24株系的有2246个,来自感病葡萄红地球的有2013个,且上调表达基因较下调表达基因更多;对差异表达基因进行GO生物功能分类发现,来自抗病毛葡萄商-24株系和感病葡萄红地球的差异基因分类情况十分相似,其中参与胁迫响应(response to stress)、细胞过程(cellular process)和代谢过程(metabolic process)的差异基因数量均为最多;对差异表达基因参与的代谢通路富集性分析表明,黑痘病菌在抗病和感病葡萄中诱导的差异表达基因和显著性富集的代谢通路大多相同,但是在抗病毛葡萄商-24株系中,抗性相关基因出现差异表达的时间和代谢通路发生富集的时间(6 h和24 h)较感病葡萄红地球(48 h和72 h)的更早,揭示抗病毛葡萄商-24株系在响应黑痘菌侵染中表现出一定的抗性特异性。3、利用半定量RT-PCR技术分析了前期从葡萄基因组中鉴定出的11个JAZ基因在根、茎、叶、卷须、花、果皮和胚珠等不同组织中的表达模式,发现JAZ基因在不同组织中的表达存在差异。对葡萄的11个JAZ基因在不同激素处理、高盐(NaCl)和干旱胁迫及病原菌侵染后的表达结果分析表明,大多数JAZ基因参与对激素处理的响应,尤其是对MeJA和ABA处理的响应,表现为显著上调表达;与MeJA和ABA相比,响应SA和ET处理葡萄JAZ基因较少。大部分JAZ基因对NaCl或者干旱胁迫处理有响应,只有少数JAZ基因参与对病原菌侵染的响应。采用同源克隆法从中国野生毛葡萄商-24株系中克隆了三个JAZ基因VqJAZ4、VqJAZ7和VqJAZ9的开放阅读框(ORF)。VqJAZ4的ORF长861bp,与欧洲葡萄VvJAZ4核苷酸序列相似性为99.19%,编码286个氨基酸残基;VqJAZ7的ORF长417bp,与欧洲葡萄VvJAZ7核苷酸序列相似性为95.8%,编码138个氨基酸残基;VqJAZ9的ORF长807bp,与欧洲葡萄VvJAZ9核苷酸序列相似性为99.13%,编码268个氨基酸残基。4、在葡萄基因组中共鉴定出126个bHLH转录因子,根据多物种系统进化树可以分为24个亚家族,属于同一个亚家族的葡萄bHLH基因往往具有相似的蛋白质及外显子/内含子结构。同线分析表明串联重复和大片段染色体复制是葡萄bHLH基因家族扩增的主要方式;葡萄和拟南芥的许多bHLH基因存在同线关系,表明这些bHLH基因可能拥有共同的祖先。利用实时定量RT-PCR技术对葡萄26个bHLH转录因子Ⅲ亚家族全部成员及部分Ⅳ亚家族成员在6种不同组织及不同激素和不同胁迫处理下的表达情况进行分析,结果显示,葡萄bHLH转录因子在不同组织中的表达模式存在差异;多数bHLH基因参与对ABA和MeJA处理的响应;部分bHLH基因对高盐(NaCl)或者干旱胁迫处理有响应,少数bHLH基因参与对病原菌侵染的响应。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S436.631

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