新型Toll样受体7激动剂抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪肺泡巨噬细胞的研究

发布时间：2017-12-26 10:58

  本文关键词：新型Toll样受体7激动剂抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪肺泡巨噬细胞的研究　出处：《西北农林科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一种以猪为唯一天然宿主的烈性传染性病毒,主要危害母猪的繁殖和仔猪的呼吸功能,给全球养猪业造成巨大的经济损失。该病毒感染猪后能造成机体的免疫抑制,形成持续性感染,并容易诱发继发性感染。PRRSV的变异速率高,几乎每年都有新毒株的出现,这给PRRSV的防控带来了巨大的困难。目前,已有的商品化PRRSV疫苗对猪群并不能提供持续有效的保护作用。抗病毒疗法为抗病毒感染提供了一个强有力的工具,尤其对于像PRRSV这样难以用疫苗控制的病毒。因此,抗病毒药物干预可能成为防控PRRSV的备选方法之一。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一类重要的模式识别受体,能够特异性识别病原体上的病原相关分子模式,在天然免疫和适应性免疫应答中发挥着重要作用。TLR7是TLRs家族的重要成员之一,主要表达于巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞上,定位于细胞质的胞内体中。TLR7能够被其特异性配体所激活,通过招募下游接头分子进行信号的级联传递,激活转录因子NF-κB、干扰素调节因子7(IFN regulatory factor 7,IRF7)等,从而诱导炎性细胞因子和干扰素的产生发挥抗病毒作用。前期我们合成了一种水溶性的新型TLR7激动剂SZU101,表现出良好的抗肿瘤效果,我们推测其可能具有抗病毒的潜力。本研究选择原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)为体外研究模型,探讨了SZU101对PRRSV的抑制作用以及作为免疫佐剂的潜力。主要取得的结果如下:1.用不同浓度的SZU101作用PAM细胞后接种病毒,通过IFA和qPCR的方法分别从蛋白和基因水平检测细胞内病毒的增殖情况。结果表明SZU101以浓度梯度依赖的方式抑制PRRSV在PAM细胞中的增殖。同时,培养上清中子代病毒滴度的下降进一步证明了SZU101对PRRSV的抑制作用。通过检测SZU101对CH-1a、JXA1、GD-HD和VR2332四种不同毒株在PAM细胞中增殖的抑制作用,证明了SZU101对PRRSV的抑制作用无毒株特异性。2.将SZU101与PRRSV直接混合后进行孵育,检测其对病毒感染力的直接影响,结果表明SZU101不能通过直接与PRRSV相互作用而影响其感染力。收集用SZU101作用PAM细胞后的培养上清,用该培养上清孵育Marc-145细胞后再进行接毒,检测到该培养上清具有抗病毒活性,提示SZU101在PAM细胞中诱导了抗病毒因子的产生。通过qPCR检测发现,SZU101作用PAM细胞后显著诱导了干扰素(IFN-β和IFN-γ)和炎性细胞因子(IL-12p40、IL-1β、IL-6和TNF-α)的表达,同时也诱导了IRF7以及IFN刺激基因ISG15和IFIT1的表达。3.通过western blot方法检测NF-κB的活化状态,结果表明SZU101作用PAM细胞后以浓度梯度依赖的方式激活了NF-κB并抑制了PRRSV的增殖。用抑制剂废除TLR7的功能后,SZU101对NF-κB的激活作用和对PRRSV的抑制作用被消除,而且细胞因子及IFN相关基因的表达也不能被诱导,说明SZU101对PRRSV的抑制、对NF-κB的激活和对细胞因子等的诱导依赖于TLR7。用特异性抑制剂抑制NF-κB功能后,SZU101对PRRSV的抑制作用以及对细胞因子和IFN相关基因的诱导作用被反转,说明SZU101诱导细胞因子等的产生和抑制PRRSV增殖依赖于NF-κB的活化。上述结果表明至少TLR7-NF-κB信号通路的激活是SZU101发挥抗PRRSV作用所必须的。4.将SZU101与PRRSV联合应用免疫Balb/c小鼠,通过ELISA、淋巴细胞增殖实验等方法检测了SZU101对PRRSV诱导的免疫应答的影响。结果表明SZU101能够促进机体针对PRRSV产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答,说明SZU101具有作为PRRSV免疫佐剂的潜力。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
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本文编号：1336948