运用高通量蛋白组学方法探索猪繁殖与呼吸系统综合征病毒非结构蛋白7和非结构蛋白12与宿主细胞蛋白的互作关系的研究

发布时间：2018-01-30 04:51

  本文关键词： 猪繁殖与呼吸系统综合征 非结构蛋白 免标记蛋白组学 互作 抑制剂实验　出处：《西北农林科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)是严重危害我国乃至全球养猪业的一种单股正链RNA病毒,它不仅在世界范围内造成了严重的经济损失,也带来了食品安全方面的诸多问题。由于RNA病毒的高变异性,市面上现有疫苗存在一定程度的局限性,因此高效稳定的疫苗和抗病毒策略的研发显得愈发重要。目前,尽管已对PRRSV进行了大量深入的研究报道,我们对一些病毒蛋白,例如非结构蛋白7(NSP7)和非结构蛋白12(NSP12)的结构和功能依然所知甚少。文献显示这些蛋白与病毒生长过程中的转录、复制进程相关,因此,了解他们在其中发挥的功能是我们亟待解决的问题。已有关于PRRSV的N,NSP1β,NSP2等蛋白及病毒粒子与宿主细胞蛋白的互作关系的研究报道,但NSP12和NSP7与宿主蛋白的互作还鲜有深入研究。本研究首先对病毒蛋白在感染细胞中的时空表达情况进行了研究。用PRRSV感染Marc-145细胞48h后,细胞感染率达到峰值。PRRSV感染PAM细胞12小时即能检出NSP12,感染Marc-145细胞24h后,NSP12蛋白的表达量达到峰值,说明在病毒侵染细胞过程中,非结构蛋白作为病毒生长周期不可或缺的一部分,会在感染初期优先表达,发挥功能。其次,我们对NSP12和NSP7在原核表达系统中进行纯化,通过条件优化得到纯度满意的NSP7蛋白,而NSP12蛋白呈包涵体状,需进一步摸索优化条件。得到的纯化蛋白为其后续功能,结构方面研究奠定必要基础。接着,经免疫沉淀实验和质谱分析鉴定出了12种与NSP7结合的宿主细胞蛋白,我们从中选取过氧化物氧化还原酶4(PRDX4)进行深入研究。用sh RNA沉默PRDX4基因表达后,PRRSV病毒滴度显著降低。对病毒蛋白与宿主细胞互作图谱的分析表明,病毒蛋白可以与大量宿主蛋白形成复杂的互作关系,并且参与到病毒和宿主的生物学进程中。最后,通过免疫沉淀实验和质谱分析,我们鉴定出112种与NSP12有潜在互作关系的细胞蛋白,并绘制出它们间的互作网络图谱。这些蛋白主要为核酸结合蛋白或分子伴侣,它们参与RNA转录后修饰、蛋白合成、细胞组成装配等进程。IPA软件预测结果表明,NSP12的表达与真核蛋白合成相关的真核起始因子-2(e IF2)信号通路显著相关。在这些蛋白中,我们挑选HSP70进行进一步分析。添加针对HSP70功能的小分子抑制剂,会显著降低病毒滴度和m RNA的合成水平。我们的数据显示,在药物安全范围内,随着HSP70抑制剂浓度的增加,NSP12-EGFP蛋白量相比于对照组明显降低,这表明,NSP12会招募一些宿主细胞蛋白例如HSP70来维持其自身稳定表达进而促进病毒的复制。在蛋白酶体抑制剂MG132存在情况下,NSP12-EGFP蛋白水平得到一定程度的恢复,进一步证实了NSP12-EGFP蛋白量降低的确是由于HSP70功能受到抑制所导致,说明NSP12与HSP70的互作关系在一定程度上起着阻止蛋白降解的作用。本论文的研究结果为在宿主蛋白中寻找药物治疗靶位点的新型治疗方法和抗病毒方案提供了理论基础和依据。
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【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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本文编号：1475336