TGEV利用表皮生长因子受体调控肠上皮细胞微丝骨架及其入胞机制的研究

发布时间：2018-02-03 11:59

  本文关键词： 猪传染性胃肠炎病毒 猪空肠上皮细胞 微丝骨架 cofilin 表皮生长因子受体　出处：《南京农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起仔猪呕吐、腹泻、脱水、肠绒毛萎缩,高死亡率为特征的高度接触传染性疾病,两周龄以下的仔猪感染死亡率达100%,成年猪带毒不发病,但是生长缓慢,不断排毒,免疫力低下,会继发感染其它病原,该病给我国养猪业造成巨大的损失。TGEV主要感染肠上皮细胞,但是其入侵机制还不清楚,细胞微丝骨架在介导病毒入侵过程中发挥着重要的作用,本实验之前研究发现TGEV感染早期能够引起肠上皮细胞微丝骨架的大量重排,但对其具体调控机制还不清楚。病毒入侵宿主细胞的第一步是同细胞膜表面受体结合,越来越多的研究发现病毒入侵宿主细胞可能需要多个受体的协同。本研究以猪肠上皮细胞(IPEC-J2)为感染模型,探索TGEV调控微丝骨架重排的机制以及TGEV入侵新受体,为防控TGEV提供一定的理论依据,本研究内容分为以下四个部分:1、TGEV SHXB毒株全基因组测序分析TGEV SHXB毒株分自中国上海,为了进一步了解其遗传进化信息,对其全基因组序列进行测序,将其序列同GenBank中已经收录的毒株序列进行了比对,比对结果显示在5'和3'非编码翻译区,非结构蛋白ORF1,ORF3和ORF7,结构蛋白E蛋白,M蛋白和N蛋白的基因组均没有外源插入或缺失;同其它毒株共有的现象是S基因第655位核苷酸都是鸟嘌呤(G ),第1753位核苷酸由胸腺嘧啶(T)突变成乌嘌呤(G ),造成第585位置丝氨酸突变成丙氨酸,该位置是S蛋白A, B抗原位点;除了 purdue强毒株(Virulent Purdue)以外所有purdue毒株在第核苷酸1123-1128处存在6个核苷酸的缺失;进化树分析发现SHXB毒株同purdue毒株进化上很靠近,同Miller毒株和猪呼吸道病毒PRCV-ISU-1毒株来源于同一祖先。2、TGEV感染早期引起IPEC-J2细胞微丝骨架的重排细胞的形状、运动、吞噬、细胞器以及细胞间的交流都需要微丝骨架的参与。已经有报道发现许多病毒感染引起微丝的重排,微丝在介导病毒入侵和内化过程中起着重要的作用。荧光显微镜观察发现TGEV (MOI = 2)感染引起微丝重排,细胞皮质层微丝重排,皮质层微丝的变化使细胞膜表面形成丝状伪足,层状伪足,片状伪足,电镜观察发现微丝围绕在病毒周围,共聚焦显微镜观察发现病毒能够同微丝共定位,利用微丝骨架蛋白抑制剂处理细胞能够显著的抑制TGEV的入侵(p 0.01),表明TGEV入侵早期能够调控宿主细胞微丝骨架的排列,同时微丝骨架蛋白在TGEV入侵过程中发挥着重要的作用。cofilin是一种微丝解聚调控因子家族成员,其在调控微丝骨架蛋白解聚过程中发挥着重要的作用,本研究发现TGEV感染早期能够引起cofilin磷酸化水平上升,过表达,干扰以及定点突变cofilin显著抑制TGEV的入侵(p 0.01 ),干扰cofilin能够显著的抑制TGEV对微丝骨架的破坏,表明TGEV感染早期通过cofilin来调控微丝骨架。3、TGEV引起IPEC-2细胞微丝骨架重排机制的研究TGEV感染早期引起IPEC-J2细胞皮质层微丝骨架重排,细胞应力纤维丝消失,微丝骨架蛋白参与TGEV早期入侵的调控,微丝解聚因子cofilin在该过程中发挥着重要的作用。我们进一步探索了 TGEV感染早期对cofilin的调控机制,定点突变Rho-GTPases家族显著的抑制TGEV的入侵(p 0.05 ),Racl和Cdc42参与了对cofilin的早期调控;Rho-GTPases家族上游调控激酶PI3K抑制剂显著抑制TGEV的入侵(P0.01 ),PI3K参与对cofilin的早期调控;表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)是酪氨酸家族(RTK)成员之一,本研究发现TGEV感染早期能够激活细胞膜表面EGFR,同EGFR共定位,抑制EGFR的活性能显著的抑制TGEV的入侵(p 0.01)和下游信号通路的激活,表明EGFR参与了 TGEV的入侵和cofilin的调控;脂筏(LipidRaft)主要由鞘磷脂和胆固醇组成,通过脂筏抑制剂去除细胞膜表面脂筏能够显著的抑制TGEV的黏附和入侵(p 0.01),TGEV感染早期促使脂筏的簇集,脂筏聚集在EGFR周围,去除脂筏能够显著的抑制TGEV对EGFR和下游信号通路的激活,表明脂筏参与了 TGEV早期对cofilin和微丝骨架的调控。结果表明TGEV感染早期通过EGFR-PI3K-Racl/Cdc42-LIMK信号通路来调节cofilin,进而对微丝骨架进行调控,促进病毒的入侵。4、EGFR介导TGEV入胞机制的研究TGEV感染早期通过EGFR-PI3K-Racl/Cdc42-LIMK信号通路来调节cofilin,对微丝骨架进行调控,介导病毒的入侵。氨肽酶N(APN)是TGEV已知的一个受体,本章进一步研究发现同时干扰APN和EGFR能更显著的抑制TGEV的入侵(p 0.01),EGFR的受体结合域1蛋白同TGEV作用后能够显著抑制TGEV入侵(p 0.05),TGEV的S1蛋白能够同EGFR胞外区受体结合域1 ( Receptorl )互作;TGEV感染早期能够促使APN和EGFR簇集,EGFR下游PI3K/AKT和ERK1/2信号通路参与了TGEV内吞的调控;干扰APN受体能够显著的抑制TGEV对EGFR的激活,APN对EGFR下游内吞信号的刺激起到协同作用;干扰小窝蛋白和网格蛋白都能显著的抑制TGEV的入侵(p 0.01),说明TGEV能通过小窝蛋白和网格蛋白介导的内吞途径内陷到胞质;正常的细胞中有大量的EGFR存在细胞膜上,TGEV感染早期能够引起大量的EGFR内陷,干扰网格蛋白抑制EGFR的内陷,证明TGEV同EGFR结合后通过网格蛋白介导的内吞途径进入胞质。结果表明:EGFR是TGEV入侵的另外一个受体,同APN.起着协同作用。
[Abstract]:In order to further understand its genetic evolution information , the whole genome sequence of TGEV infected host cells was identified as guanine ( G ) , but its invasion mechanism was not clear . The results showed that the genome sequence of TGEV infected host cells was guanine ( G ) , and the 1753 nucleotide was mutated to guanine ( G ) by thymidine ( T ) . In addition to purdue virulent strain ( Virulent Purdue ) , all purdue strains had 6 nucleotides deletion at nucleotide 1123 - 1128 . It was found that SHXB strain was closely related to purdue strain . It was found that TGEV infection can inhibit the invasion of TGEV ( p 0.01 ) . It is suggested that TGEV can inhibit the invasion of TGEV ( p 0.01 ) . The effect of TGEV on the activation of EGFR and EGFR in early stage of TGEV infection can significantly inhibit TGEV invasion ( p 0.01 ) .

【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.651

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本文编号：1487325