烟草WD40蛋白TTG2和转录因子ARF8对生长发育和抗病性的调控作用

发布时间：2018-03-04 22:08

  本文选题：烟草　切入点：NtTTG2　出处：《南京农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：植物TTG (TRANSPARENT TESTA GLABRA)蛋白的功能被假定为参与生长素信号通路然后调节一系列的生长发育过程。植物的生长发育主要受生长素信号通路的控制,生长素应答因子(auxin response factor,ARF)参与生长素信号传导转录调控。本博士论文主要研究了 WD40结构域蛋白NtTTG2和转录因子NtARF8对植物生长发育的调控作用。生长素可以通过抑制水杨酸信号传导来抑制抗病防卫反应。本论文从表型上研究了转录因子NtARF8对烟草抗病性的影响。这些研究有助于进一步理解植物生长发育机制,同时为阐明植物生长发育信号通路和抗病防卫反应信号通路的交叉调控提供了理论基础。1.NtARF8 NtARF17,NtARF19参与NtTTG2调控的植物生长功能通路TTG蛋白早期被鉴定为植物表皮和种子发育的核心调节子,在功能调控这一方面一直受到长期的关注。为了验证NtTTG2与植物生长素之间的关系,我们用生长素合成剂NAA处理了烟草叶片,实验表明用NAA处理后NtTTG2的表达量有明显的增加,这个结果说明NtTTG2能够感应生长素。同时,我们检测了野生型植株、TTG2沉默植株、TTG2过表达植株中叶片、花、果实中的生长素IAA含量,发现这三种植株的相同器官上的生长素含量没有明显的变化,说明NtTTG2不影响内源生长素的含量。基于先前实验室对NtTTG2的转录组实验研究数据,通过生物信息学分析比对,我们发现了包括NtARF8、NtARF17和NtARF19在内的12个受NtTTG2调控表达的生长素受体因子(ARF)。通过病毒介导的沉默方法(Virus-Induced Gene Silencing , VIGS)将这12个ARFs在野生型植株、TTG2沉默植株、TTG2过表达植株中分别进行了瞬时沉默。荧光定量PCR实验分析表明成功沉默了这些ARF基因,同时发现NtTTG2能够增加NtARF8、NtARF17和NtARF1夕的表达量。通过生长表型的观察和植物重量变化的测定发现:当NtARF8、NtARF17和NtARF19沉默时,与对照组相比,植株的生长和重量受到抑制,结果表明NtTTG2能够通过调控NtARF8、NtARF17和NtARF19从而正调控植物的生长发育。2. NtARF8作为转录激活子促进植物生长发育为了进一步研究并验证NtARF8、NtARFJ7、NtARF19在NtTTG2调控生长发育信号通路中的作用,我们对这三个基因进行了两两之间的沉默和三个基因的同时沉默。荧光定量PCR实验分析发现这三个基因的沉默都是独立的,其中一个基因的沉默不会影响另外两个基因的表达。通过分析不同基因型植株的重量变化倍数,发现NtARF8基因沉默相较于NtARF17和NtAF19的沉默对烟草的生长有更明显的抑制作用。通过测定野生型植株、TTG2沉默植株、TTG2过表达植株中根、茎、叶、花、果实中NtARF8的表达量,分析发现在不同器官中NtARF8的表达量受到NtTTG2的正向调控,结果表明NtARF8还参与由NtTTG2介导的其它生长发育过程。我们分别观察了野生型植株、TTG2沉默和过表达植株、ARF8沉默和过表达植株以及TTG2、ARF8同时沉默和过表达植株的生长情况以及果实种子的发育情况,并对植株高、重量、种子的产量进行数量统计,发现NtTTG2、NtARF8能够促进植物的生长发育和烟草种子的产量。通过对NtARF8蛋白质氨基酸序列分析发现其中间区域包含了富含谷氨酰胺的保守序列,我们预测它可能是一个转录激活子。为了验证这一假设,实验中我们引入GH3基因,GH3基因是一个被证实的生长素早期应答因子,它的启动子上有两段典型的生长素应答元件TGTCT的重复序列。通过凝胶电泳迁移率分析(GMSA)和染色质免疫共沉淀(ChIP)实验发现NtARF8能够与GH3基因的启动子特异性的结合,结果表明NtARF8作为转录激活子行使其功能。3. NtTTG2通过促进NtARF8的细胞核定位从而增强它作为转录激活子的作用通过酵母双杂交和荧光双分子互补实验发现NtTTG和NtARF8不能够直接互作。以TTG2沉默的TTG2i植株、带有RFP标签的WT植株、融合RFP的TTG2过表达的TTG2+:RFP植株为材料,对融合黄色荧光蛋白YFP的ARF8进行瞬时表达,然后采用激光共聚焦显微镜对YFP的瞬时表达情况进行仔细观察。结果表明ARF8的细胞定位受到TTG2的影响。ARF8在TTG2+:RFP植株中主要定位于细胞核,但在TTG2i植株中只有较弱的荧光,说明TTG2促进ARF8定位到细胞核。将ARF8在WT:RFP、TTG2+:RFP、TTG2i植株中瞬时表达后,通过蛋白质免疫印迹实验发现在TTG2过表达植株中ARF8蛋白在细胞核中的表达量增加了,而在TTG2沉默植株中ARF8的蛋白量不管在细胞质和细胞核中都明显的降低了,说明TTG2的沉默或过表达影响了 ARF8蛋白在细胞质和细胞核的表达量分布。结合ChIP和qRT-PCR实验发现在TTG2过表达的植株中,ARF8和GH3启动子的结合能力明显的提高了,而且在过表达植株中GH3基因的表达含量明显上升。这些结果表明NtTTG2通过促进NtARF8的细胞核定位从而增强它作为转录激活子的作用。4. NtTTG2和NtARF8对植物抗病性的影响前面的内容我们主要讨论了 NtTTG2和NtARF因子对烟草生长发育的影响。本章我们主要从表型方面观察研究了 NtTTG2和NtARF8对植物抗病性的影响。本实验室已经研究表明,TTG2能够负调控植物的抗病性,而这主要是由于其能够对植物的防卫反应(主要由SA/NPR1信号通路介导)产生抑制作用。我们在不同TTG2基因型烟草上利用病毒沉默技术沉默了NtARF 基因,然后对烟草叶片分别接种烟草花叶病毒(TMV)和大白菜软腐病菌(Pcc),并用缓冲液作为对照,随后观察发病表型并检测了发病程度。结果表明,与野生型植株相比,TTG2沉默后植物的抗病性升高了,而当TTG2过表达后植物感病严重,这与实验室之前的研究结果一致;而ARF8基因沉默后也会提高植物的抗病性;当这两个基因同时沉默时,植物的抗病性比它们各自单独沉默时都提高了。实验结果表明NtTTG2和NtARF8对植物的抗病性有负调控作用。5.酵母双杂筛选AtTTG1蛋白的互作因子TTG蛋白是一个典型的WD40结构域蛋白,WD40蛋白的主要功能是与其他蛋白质互作,形成复合体结构,从而调控下游的反应。先前的实验表明,NtARF8和NtTTG2两者之间不存在直接互作,根据实验结果推测,NtTTG2在调节NtARF8的过程中还存在其它作用因子。实验室先前对氨基酸序列进行同源性对比表明,NtTTG2与AtTTG1、NtTTG1的同源性很高(77.7%)。于是我们在拟南芥文库中利用酵母双杂交技术去筛选能够与AtTTG1蛋白互作的相关因子。如果能筛选得到相应的蛋白在反推去研究与NtTTG2互作的相关蛋白。本实验以AtTTG1为诱饵,对拟南芥cDNA文库进行筛选,并利用营养缺陷型和β -半乳糖苷酶活性初步筛选到35个阳性克隆,测序并在GenBank中进行序列比对并进行功能分析,为研究TTG蛋白的相关互作机制提供了理论依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S572;S435.72

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本文编号：1567505