不同油茶无性系对低磷胁迫的响应及其分子基础研究

发布时间：2021-03-26 22:05

油茶(Camellia oleifera Abel)是我国特有的木本食用油料树种之一,广泛分布于在我国南方山地丘陵地区。该树种生长的土壤中有效磷含量很低,而磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一,土壤缺磷是限制油茶生长发育和产量的关键因子。油茶在进化过程中形成了一系列复杂的适应低磷的响应,包括根系形态和生理生化上的一些适应性调整。因此,充分利用油茶资源的遗传多样性,通过筛选磷高效利用油茶品种,挖掘油茶磷高效利用相关的基因及其功能,并通过分子标记辅助育种和基因工程育种来提高油茶磷利用效率是解决油茶林地土壤缺磷的有效途径。本文以两个磷利用效率存在显著差异的油茶无性系扦插苗为试验材料,研究了低磷胁迫下的生理生化响应,筛选出了评价油茶磷高效利用的相关指标;进一步利用转录组分析和荧光定量PCR分析,筛选出了磷高效利用相关的基因。主要研究结果如下:1.低磷胁迫下两个无性系生理生化指标比较分析,筛选油茶磷高效利用评价的相关指标。(1)在低磷胁迫下,两个油茶无性系的苗高、生物量(根、茎、叶和全株)、根系参数(总根长、表面积和体积)和磷吸收效率(磷积累量)均显著降低,而根冠比和磷利用效率显著增高;长林166号的苗高、根系和整株的生物量、根系参数、根冠比和磷利用效率均显著高于长林4号,说明长林166号相对长林4号为磷高效利用基因型无性系。(2)低磷胁迫下,两个油茶无性系根系中的酸性磷酸酶、有机酸合成相关酶(CS、NAD-MDH和PEPEC酶)、抗氧化性保护酶(SOD、POD和CAT酶)活性均显著上升;且两个油茶无性系根系中的生长素(IAA)、赤霉素(GA)和脱落酸(ABA)均显著上升而分裂素(ZR)显著下降低;长林166号根系中酸性磷酸酶活性,有机酸相关酶活性、抗氧化性保护酶(SOD、POD)活性和内源激素含量均比长林4号高。(3)低磷胁迫后,两个油茶无性系叶片叶绿素、光合气体交换参数(Pn、Tr、Gs和Ci)、叶绿素荧光参数(Fv/Fm、Y(II)、q L和ETR)均显著降低,而叶绿素荧光参数(Y(NPQ)、Y(NO)和qN)均升高。低磷胁迫下,长林166号的叶绿素、Pn、Tr、Gs、Ci、Fv/Fm、Y(II)、qL和ETR值均比长林4号高,而Y(NPQ)、Y(NO)和qN比长林4号低,说明长林166号受到低磷胁迫的伤害较长林4号轻,光合效率比长林4号高。(4)根据生理指标的相关分析结果,筛选出根系干重、总生物量、根冠比作为大规模筛选磷高效油茶品种的关键指标;磷利用效率作为确认的指标;光合气体交换参数和叶绿素荧光参数可作为辅助筛选指标,可用于油茶无性系耐低磷能力的早期鉴定。2.不同磷水平下两个油茶无性系根系转录组分析。转录组测序获得了614,364,144条clean reads,Q20均在97%以上。通过组装共获得了208,506个unigene,平均长度785bp,N50平均长度为1452bp。根据166LP-VS-166HP与166LP-VS-4LP的差异基因,筛选出磷转运蛋白家族基因(Pht1,1、Pht1,2、Pht1,4、Pht1,9、pho1-1、Pho1-3)、酸性磷酸酶家族基因(PAP1、PAP2、PAP3、PAP18)、有机酸分泌相关基因(CS、NAD-MDH、PEPC和ALMT)、转录因子PHR2和根系调控相关基因PDR2一共16个基因,这些基因可能是长林166号的磷高效利用的相关基因。3.磷高效相关基因对低磷的响应以及在不同无性系不同磷水平下的表达分析。根据相关基因的表达分析并结合其在磷吸收和磷信号调控中的作用,筛选出PHR2、PDR2、CS、ALMT、Pht1,9、Pho1-3和PAP1基因可能是长林166号磷高效利用的关键基因。4.PHO1-3、ALMT、CS和PHR2基因的克隆和生物信息学分析。通过RT-PCR技术,从油茶根系中分离出了磷转运子基因CoPHO1-3、铝激活苹果酸转运体基因CoALMT、柠檬酸合成酶基因CoCS和转录因子CoPHR2。它们的CDS全长依次为2406bp、1761bp、1416bp和1419bp,分别编码801AA、586AA、471AA和472AA。通过与来源于其他物种的基因的聚类分析,发现CoPHO1-3蛋白与芝麻、野生大豆和大豆的PHO1-3蛋白亲缘关系较近。CoALMT、CoCS和CoPHR2蛋白与葡萄的亲缘关系较近。5.CoCS和CoPHR2基因转化拟南芥。通过Gateway技术构建了CoCS和CoPHR2基因的植物表达载体,通过农杆菌浸染花蕾法转化拟南芥,经潮霉素抗性筛选和PCR检测,最终筛选获得拟南芥cs突变体和野生型WT转CoCS基因的阳性转基因株系分别为6个和5个;拟南芥phr1突变体和野生型WT转CoPHR2基因的阳性转基因株系分别为8个和6个。
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S794.4

文章目录

摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 引言

1.1.1 研究的背景

1.1.2 国内外研究现状及评述

1.2 研究的目的意义和主要内容

1.2.1 研究的目的意义

1.2.2 主要研究内容

1.2.3 技术路线

第二章不同油茶无性系对低磷胁迫的响应

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 低磷胁迫对两个油茶无性系生长的影响

2.2.2 低磷胁迫对两个油茶无性系磷效率的影响

2.2.3 低磷胁迫对两个油茶无性系酸性磷酸酶活性的影响

2.2.4 低磷胁迫对两个油茶无性系有机酸合成相关酶活性的影响

2.2.5 低磷胁迫对两个油茶无性系保护酶活性的影响

2.2.6 低磷胁迫对两个油茶无性系光合特性的影响

2.2.7 低磷胁迫对不同油茶无性系内源激素的影响

2.2.8 油茶磷高效利用评价指标的筛选

2.3 本章小结

第三章不同磷水平下两个油茶无性系根系转录组分析

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 测序评估

3.2.2 Unigene组装及结果分析

3.2.3 Unigene注释及分类

3.2.4 Unigene代谢通路分析

3.2.5 表达量分析

3.2.6 差异基因表达分析

3.2.7 差异Unigene功能分析

3.2.8 磷高效利用相关基因的筛选

3.3 本章小结

第四章油茶磷高效利用相关基因的表达分析

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 油茶磷高效利用相关基因对低磷的响应

4.2.2 两个无性系磷高效相关基因的表达差异分析

4.2.3 油茶磷高效利用关键基因的筛选

4.3 本章小结

第五章油茶磷高效利用关键基因的克隆及其生物信息学分析

5.1 材料与方法

5.1.1 实验材料

5.1.2 实验方法

5.2 结果与分析

5.2.1 PHO1-3 基因的克隆与生物信息学分析

5.2.2 ALMT基因的克隆与生物信息学分析

5.2.3 CS基因的克隆与生物信息学分析

5.2.4 PHR2基因的克隆与生物信息学分析

5.3 本章小结

第六章 CoCS和CoPHR2基因对拟南芥的遗传转化

6.1 材料与方法

6.1.1 实验材料

6.1.2 实验方法

6.2 结果与分析

6.2.1 植物表达载体的构建

6.2.2 拟南芥转化及鉴定

6.3 本章小结

第七章结论与讨论

7.1 结论

7.1.1 不同油茶无性系对低磷胁迫的响应及磷高效利用评价指标的筛选

7.1.2 两个无性系磷利用效率差异的分子基础研究及磷高效利用相关基因的筛选

7.1.3 油茶磷高效利用关键基因的克隆和生物信息学分析

7.1.4 CoCS和CoPHR2基因对拟南芥的遗传转化

7.2 讨论

7.2.1 不同油茶无性系对低磷胁迫的响应及磷高效利用评价指标的筛选

7.2.2 两个无性系磷利用效率差异的分子基础研究及磷高效利用相关基因的筛选

7.2.3 磷高效利用关键基因的克隆和生物信息学分析

7.2.4 CoCS和CoPHR2基因对拟南芥的遗传转化

7.3 展望

参考文献

在读期间的学术研究

致谢

【参考文献】