WN10蛋白生物学功能的研究及旋毛虫病免疫学检测方法的建立

发布时间：2017-01-01 00:26

  本文关键词：WN10蛋白生物学功能的研究及旋毛虫病免疫学检测方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

《吉林大学》 2015年

WN10蛋白生物学功能的研究及旋毛虫病免疫学检测方法的建立

唐斌  

【摘要】：旋毛虫病是由人与动物生食或半生食寄生有旋毛虫的肉类而引起的一种人兽共患寄生虫病,对公共卫生和畜牧业都构成极大的威胁。2012年WHO/FAO食源性寄生虫病委员会依据疾病对人体的危害程度及经济损失进行排名,旋毛虫病在所有的食源性寄生虫病中位居榜首。 旋毛虫的发育时期包括肌幼虫期,成虫期、新生幼虫期,而肌幼虫侵入肠壁后至发育为成虫前亦被称为肠道感染性幼虫。由于旋毛虫在不同发育时期其抗原表达存在明显差异,因而仅以单一时期单个抗原蛋白作为诊断抗原特异敏感地检测旋毛虫病难以实现。目前市售的旋毛虫ELISA检测试剂盒主要采用的诊断抗原为肌幼虫的排泄分泌(excretory/secretory, ES)产物,仅能于旋毛虫感染3-4周后检测到抗体,而旋毛虫新生幼虫于感染第14-16天即可发育为具有感染性的肌幼虫,故存在明显的诊断盲区,这也导致以旋毛虫肌幼虫ES产物作为诊断抗原的免疫学检测方法至今无法应用于屠宰动物检验与临床诊断,而只能采用相对更为费时费力的镜检法和集样消化法,在临床诊断上也仅能作为辅助检测。 本研究中,课题组根据本实验室前期构建的旋毛虫不同发育时期的cDNA文库的免疫筛选结果,分别从每个发育时期选取了一个高丰度强反应原性的抗原蛋白,分别是肌幼虫的Ts-serpin、肠道感染性幼虫的WN10、成虫的Ts-Adsp和新生幼虫的Ts-NBLsp。利用pET-28a质粒构建了WN10、Ts-Serpin和Ts-Adsp的原核表达载体,并表达、纯化获得了相应的重组蛋白。此外,采用overlapping方法对旋毛虫Ts-NBLsp抗原蛋白进行了抗原表位筛选,从构建的13条十肽中,成功地筛选到了两个强反应原性小肽NBLsp4和NBLsp12。 通过联合应用WN10、Ts-Adsp、Ts-serpin重组蛋白和BSA偶联的强反应原性小肽NBLsp4、NBLsp12,建立并优化了旋毛虫病无诊断盲区ELISA检测方法。实验结果表明所建立的ELISA检测方法无论在高感染剂量还是低感染剂量旋毛虫感染模型中,均能于感染后第15天成功检测到抗体,较以肌幼虫ES产物作为诊断抗原的ELISA方法提前至少8天检测到抗体,不仅解决了旋毛虫ES产物作为抗原所导致的诊断盲区问题,而且克服了ES产物制备生产周期长、成本高和二次污染风险等缺点。 在对WN10进行序列分析时,发现其具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域。半胱氨酸蛋白酶抑制剂除具有酶抑制活性之外,还可在寄生虫逃避宿主的免疫应答及在宿主体内营寄生生活中发挥重要作用,因此将半胱氨酸蛋白酶抑制剂作为免疫调节剂可能会有良好的应用前景。对WN10序列与其他寄生虫的半胱氨酸蛋白酶比较,发现其活性位点发生了突变,并没有典型的Q×V×G基序,通过azo-casein活性检测和反向酶谱实验证明WN10蛋白在体外无半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性。通过体外实验证明了重组WN10蛋白能够在体外诱导腹腔巨噬细胞NO水平上调。此外,WN10蛋白能够诱导LPS活化的腹腔巨噬细胞产生TNF-α和IL-10,而且也能够单独诱导腹腔巨噬细胞产生TNF-a和IL-10,从而表明WN10蛋白可能调节宿主免疫向Th2极化,从而为旋毛虫营寄生生活创造有利条件。

【关键词】：
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S855.9
【目录】：

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