阿维菌素抗性、敏感小菜蛾转录组分析及CYP340W1基因功能分析

发布时间：2019-01-17 19:20

【摘要】：小菜蛾起源于地中海地区或南非地区,但这种农业害虫现在广泛分布于世界各地。小菜蛾危害严重,往往可以导致90%以上的作物损失。最近的研究估计,每年由小菜蛾造成的经济损失高达40-50亿美元。自上个世纪70年代起,小菜蛾逐渐成为十字花科蔬菜的主要害虫,在中国绝大部分十字花科作物主产区都有发生。阿维菌素自问世以来就被用作防治小菜蛾的主要药剂而被广泛使用。然而,快速增长的阿维菌素抗性对这种小菜蛾防治策略产生了威胁。2007年在我国云南地区采集的小菜蛾的阿维菌素抗性倍数甚至高达5,000倍。本实验室饲养的抗性品系小菜蛾(ABMR)长期使用阿维菌素汰选。与敏感品系小菜蛾(ABMS)相比,抗性品系小菜蛾的抗性倍数高达217.68倍。为了明确小菜蛾阿维菌素抗性的分子机制,通过转录组来分析阿维菌素抗性、敏感品系小菜蛾的转录水平差异。抗性、敏感品系各设置3个生物学重复。总计获得了大约45 Gb的数据,平均每个样品获得了 7.6 Gb数据。敏感品系(ABMS)获得了 219,214,576条reads,其中49.95%的reads可以比对到小菜蛾基因组上。抗性品系(ABMR)获得了126,185,708条reads,其中约有52.72%可以比对到小菜蛾基因组。在筛选标准为padj0.05的条件下,共有76个上调和65个下调基因差异表达。GO聚类分析发现,141个差异转录本被归为30个GO term,主要为生物学过程、代谢过程、催化活性、有机物代谢过程、大分子代谢过程。昆虫的细胞色素氧化酶P450的催化作用对昆虫抗药性的形成起到了重要作用。转录组数据分析发现P450基因在抗性品系中的上调表达是导致阿维菌素抗性的重要因素之一。本研究首次报道了一个新的P450基因,利用RACE技术克隆得到小菜蛾P450基因全长,该基因被命名为CYP340W1,隶属于CYP4家族。该基因开放阅读框(ORF)长1491bp,5'-UTR长139 bp,3'-UTR长 299 bp,其中包含一个长26 bp的polyA尾。基因编码496个氨基酸,蛋白分子量56Kda,等电点为9.18。本研究所获得的小菜蛾的CYP340W1基因具有典型的细胞色素氧化酶P450超家族的保守结构域,即血红素保守结合区,其氨基酸序列为PF××G×R×C×G/A,包含绝对保守的半胱氨酸。CYP340W1基因在抗性品系小菜蛾(ABMR)四龄幼虫中的表达量显著高于敏感系,差异倍数达到5.66倍。该基因的表达还受到阿维菌素的影响。小菜蛾幼虫接触阿维菌素将会导致P450基因转录水平的变化。小菜蛾幼虫饲喂阿维菌素72小时后CYP340W1基因的表达量显著升高1.5倍。本实验利用显微注射dsRNA技术介导的RNA干扰来研究CYP340W1基因的功能,结果显示CYP340W1基因可能与小菜蛾的阿维菌素抗性相关。小菜蛾幼虫注射dsRNA并饲喂阿维菌素72h后,幼虫的死亡率显著升高。幼虫生测结果表明:注射dsRNA的三龄幼虫饲喂2.5 mg/L阿维菌素后死亡率为86.7%,显著高于对照组的56.7%。因此,这个新P450基因代谢阿维菌素的能力在小菜蛾阿维菌素抗性中起到重要作用。此外,本实验构建了重组表达载体用于异源表达。以大肠杆菌菌株TransSetta(DE3)作为原核表达宿主,重组载体转化至宿主细胞后,对表达条件进行了优化。重组表达该基因的最优培养条件为于16℃添加0.01 mM的IPTG。最后,利用免疫印记法(Western blot)确认了重组蛋白的成功表达。
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【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S433.4

【参考文献】