14-3-3γ调控脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应和泌乳

发布时间：2019-04-23 23:01

【摘要】：随着人们生活水平的不断改善,奶产品在整个国民经济中所占的地位日益提高。为了提高产奶量,往往在奶牛饲粮中添加大量高精饲料,这样做虽然在一定程度上提高了奶牛的产奶性能,但却非常容易引发瘤胃亚急性酸中毒(subacute rumen acidosis,SARA)。作为一种常见的代谢疾病,SARA的发病率较高,在奶牛泌乳早期和中期高达20%以上,并且有逐年上升的趋势,这给奶牛养殖业造成了极大的经济损失。当SARA发生时,瘤胃内的细菌脂多糖(lipopolysaccharid,LPS)浓度增加,刺激机体释放大量的炎症细胞因子,致使机体产生一系列的炎症反应和代谢模式的变化,从而导致奶牛的产奶量和奶品质下降。因此,如何抑制LPS诱导的炎性细胞因子的产生,提高产奶量成为我们迫切需要解决的重要奶业科学问题。14-3-3蛋白家族是高度保守的二聚体蛋白,广泛地存在于几乎所有生物体细胞中,在哺乳动物中有7种亚型(β、γ、ε、δ、ε、ζ和η),在抑制细胞凋亡、介导细胞信号转导、调控细胞周期等方面发挥着重要作用。大量研究表明,14-3-3γ参与了许多疾病的发生、发展过程,并在一些病理过程中表达量升高。这些研究结果提示我们,14-3-3γ可能在提高机体对损伤的反应性以及抗损伤修复等方面非常重要。本项目前期研究结果显示,奶牛乳腺上皮细胞中14-3-3γ过表达能够有效促进乳蛋白和乳脂肪的合成,并能够显著提高奶牛乳腺上皮细胞的活性。那么,14-3-3γ是否能通过抑制炎症信号转导通路和促进泌乳功能进而提高SARA奶牛的产奶量和奶品质就成为了我们研究的重点。本研究中,利用组织块培养法成功地获得了原代奶牛乳腺上皮细胞,并建立了体外细胞泌乳模型;通过检测不同浓度LPS对奶牛乳腺上皮细胞的毒性作用,筛选出了最佳的LPS浓度用以复制细胞炎症模型;用CASY-TT方法、LDH活性测定法、吖啶橙荧光染色法和流式细胞技术检测了奶牛乳腺上皮细胞的活性、增殖能力和凋亡情况;利用脂质体转染法使得14-3-3γ在奶牛乳腺上皮细胞中进行超表达或基因沉默;应用实时荧光定量RT-PCR法及蛋白免疫印迹(Western blotting)技术检测了泌乳相关基因的mRNA和蛋白表达变化;用Western blotting技术检测了β-酪蛋白的表达变化和炎症通路中相关基因的蛋白表达变化;用实时荧光定量RT-PCR法和ELISA法测定了炎性细胞因子m RNA表达和分泌情况;用甘油三酯试剂盒和乳糖检测试剂盒检测了奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯和乳糖的含量变化;用酶活性试剂盒检测了脂肪酸合成酶活性变化。本实验研究结果表明:1.LPS对奶牛乳腺上皮细胞具有一定的毒性作用CASY分析法、LDH活性测试法、吖啶橙荧光染色法及流式细胞技术的检测结果表明,LPS可以降低奶牛乳腺上皮细胞的活性和增殖能力、诱导细胞凋亡,并且这种毒性作用具有一定的剂量-效应关系和时间-效应关系。2.LPS影响奶牛乳腺上皮细胞的泌乳功能和泌乳相关基因的表达①检测奶牛乳腺上皮细胞分泌甘油三酯、乳糖及β-酪蛋白的结果表明,LPS能显著降低奶牛乳腺上皮细胞的泌乳功能。当LPS浓度大于等于100ng/mL时,甘油三酯含量与对照组相比较显著降低(P0.05);当LPS的浓度大于等于1 000ng/mL时,乳糖含量与对照组相比显著降低(P0.05);当LPS浓度大于100ng/mL时,奶牛乳腺上皮细胞内?-酪蛋白的表达降低。②荧光定量RT-PCR检测表明,LPS下调奶牛乳腺上皮细胞泌乳有关基因的mRNA表达。与对照组相比,1 000ng/mL LPS能显著降低mTOR、STAT5、S6K1、AKT1、4EBP1、PPARγ、SREBP1、FABP3、ACC、FAS和GLUT1的mRNA表达量(P0.05或P0.01)。③Western blotting检测表明,LPS下调奶牛乳腺上皮细胞泌乳有关基因的蛋白表达,与对照组相比,1 000ng/mL LPS能显著抑制m TOR、p-m TOR、S6K1、p-S6K1、AKT1、p-AKT1、SREBP1、PPARγ和GLUT1的蛋白表达(P0.05)。3.LPS引起奶牛乳腺上皮细胞14-3-3γ表达升高,提示14-3-3γ可能参与LPS诱导的炎症反应过程。4.14-3-3γ超表达抑制LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞分泌炎性因子和下调炎症相关信号通路①荧光定量RT-PCR和ELISA检测表明,14-3-3γ超表达可以明显抑制LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β和i NOS的m RNA表达,并且显著降低奶牛乳腺上皮细胞培养上清液中TNF-α和IL-6的含量,与LPS组相比差异显著(P0.05)。②Western blotting检测表明,14-3-3γ超表达抑制TLR4蛋白的表达,下调NF-κB和MAPK信号通路。14-3-3γ超表达抑制IκB-α、ERK1/2和p38的磷酸化以及NF-κB的核转位,与LPS组相比差异显著(P0.05)。5.14-3-3γ对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞活性及其泌乳的影响①CASY分析法、流式细胞技术等检测结果表明,与LPS对照组相比,14-3-3γ超表达促进LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞的活性和增殖能力,抑制细胞凋亡;与LPS对照组相比,14-3-3γ基因沉默抑制LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞活性和增殖能力,促进细胞凋亡,提示14-3-3γ对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞的损伤有保护作用。②检测细胞分泌甘油三酯、乳糖和β-酪蛋白结果表明,与LPS对照组相比,14-3-3γ超表达能促进LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞乳脂、乳糖和乳蛋白的合成和分泌;与LPS对照组相比,14-3-3γ基因沉默抑制LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞乳脂、乳糖和乳蛋白的合成和分泌。③荧光定量RT-PCR及Western blotting检测表明,与LPS对照组相比,14-3-3γ超表达增加mTOR、S6K1、AKT1、PPARγ、SREBP1和GLUT1的mRNA和蛋白表达量;与LPS对照组相比,14-3-3γ基因沉默减少m TOR、S6K1、AKT1、PPARγ、SREBP1和GLUT1的m RNA和蛋白表达量。综上,14-3-3γ在奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中发挥重要的抗损伤保护作用。14-3-3γ可以通过降低NF-κB和MAPK信号通路的活性而抑制TNF-α、IL-6、IL-1β和i NOS的分泌,减轻奶牛乳腺上皮细胞炎症反应,并且14-3-3γ能增加泌乳相关基因的表达,从而促进LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞的活性、增殖能力和乳成分的合成、分泌。本研究为有效控制LPS引起的奶牛泌乳能力下降和提高乳品质提供了新的实验依据和理论参考。
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【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.23

【参考文献】