BBTV抗菌蛋白与血蓝蛋白抗菌肽的抑菌活性研究

发布时间：2017-03-18 09:04

  本文关键词：BBTV抗菌蛋白与血蓝蛋白抗菌肽的抑菌活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在动植物中,抗菌肽(AMP)是抵御微生物入侵的重要屏障,在先天性免疫中扮演重要角色。抗菌肽来源丰富,许多抗菌资源还有待于开发利用,尤其高效的抗真菌肽(或蛋白)还鲜有报道。农作物上由土传尖孢镰刀菌引起的枯萎病危害严重,目前尚无长期有效的防控手段。特别是由尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Foc-TR4)引起的香蕉枯萎病在世界香蕉产区流行,威胁到80%的香蕉产量。在此,鉴于束顶病植株具有抗枯性,则暗示BBTV对以维管束组织为共侵染点的Foc产生拮抗。本论文进一步研究表明BBTV的基因沉默抑制子B4(特异地定位于维管束组织的细胞外膜上)赋予对Foc的拮抗作用。纯化的B4蛋白在体外有效(90%)抑制Foc分生孢子萌发和菌丝生长。并且,B4GFP转基因番茄在整个生育期对尖孢镰刀菌番茄专化型(Fo1)具备良好抗性。在对Fol胁迫下的野生型(WT)和转基因番茄进行基因差异表达谱分析,结果表明转基因植株的光合系统相关基因的转录表达大幅度(50×)上调,而植物与病原物互作(或免疫相关)相关基因的转录水平呈下调的,这可能是B4蛋白阻抑Foc的入侵未能使得寄主大量激活效应子触发的免疫(ETI)。BBTV对尖孢镰刀菌的拮抗为病原微生物菌群在单一植物中的动态演化提供一个新范例。另外,细菌病也严重影响农作物生产,尤其是由细菌耐药性给病害防控所带来的问题。抗菌肽通常靶向作用细菌质壁组分,可有效降低病原细菌耐药性的产生。无脊椎动物生物(如节肢动物和软体动物)在微生物环境活动,体内一般以抗菌肽防御细菌入侵。节肢动物的血蓝蛋白(载氧蛋白,也是先天性免疫分子)已被证实为抗菌肽前体,但软体动物的还未见报道。本论文发现候选抗菌肽(命名为haliotisin),来自软体动物鲍(Haliotis tuberculata)血蓝蛋白Ⅰ型亚基(HtH1)的功能体FU-E中连接α螺旋结构域和β片层结构域的linker序列,位于血蓝蛋白中空圆柱体颗粒的中心部位内壁上。通过合成重叠肽进行抗菌测试表明多肽P3-P4-P5(DTFDYKKFGYRY DSLELE GRSISRIDELIQQRQEKDRTFAGFLLKGFGTSAS)兼具对革兰氏阳性菌(B.subtilis)和阴性菌(E.carotovora)的抗性,且对阳性菌抑制活性甚高；经抗菌肽处理后的细菌经电镜观察,其细胞质壁损伤严重。鲍血蓝蛋白作为新型广谱抗菌肽的来源,其作用机理有待于继续研究。本论文首次鉴定了病毒源的候选抗真菌蛋白B4以及源自软体动物血蓝蛋白的抗细菌肽(haliotisin),这两者都属于抗菌免疫分子,分别为抗枯和抗细菌转基因育种提供新的抗性资源。
【关键词】：香蕉束顶病毒 尖孢镰刀菌 拮抗 B4蛋白 鲍血篮蛋白 抗菌肽 先天性免疫
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S436.68
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 引言11-12
• 第一章 香蕉束顶病毒B4蛋白拮抗尖孢镰刀菌的分析12-47
• 1 前言12-25
• 1.1 香蕉束顶病毒12-19
• 1.1.1 香蕉束顶病毒的典型致病特征12-13
• 1.1.2 香蕉束顶病的发生、传播方式及病害流行13-14
• 1.1.3 感病植株的细胞病理学特性及变化14
• 1.1.4 BBTV粒体形态及其分类地位14-15
• 1.1.5 BBTV的基因组结构及其各组分编码蛋白15-17
• 1.1.6 植物病毒抑制寄主RNA沉默的策略及BBTV基因沉默抑制子的特征17-19
• 1.2 香蕉枯萎病的危害及其防控策略19-25
• 1.2.1 香蕉枯萎病的典型症状及其病原尖孢镰刀菌19-21
• 1.2.2 香蕉枯萎病的防控策略21-22
• 1.2.3 抗性基因的导入和寄主诱导的基因沉默(HIGS)是抗真菌的有效方式22-25
• 2 材料与方法25-32
• 2.1 材料与试剂25
• 2.1.1 香蕉束顶病毒毒源和本氏烟25
• 2.1.2 菌种与质粒25
• 2.1.3 试剂25
• 2.2 实验方法25-32
• 2.2.1 序列比对25
• 2.2.2 蛋白B4的表达和纯化25-26
• 2.2.3 荧光抗体的交联26
• 2.2.4 B4抗血清的制备及其抗体IgG的纯化26-27
• 2.2.5 PVX重组载体的构建以及农杆菌浸润本氏烟27-28
• 2.2.6 植物总蛋白提取及western blot分析28
• 2.2.7 透射电镜观察28
• 2.2.8 B4蛋白体外拮抗Foc的活性分析28-29
• 2.2.9 植物表达载体的构建和番茄转化29
• 2.2.10 DEG(差异表达基因)的文库构建及其差异聚类分析29-31
• 2.2.11 定量PCR验证分析31-32
• 3 结果与分析32-43
• 3.1 感染BBTV的香蕉增强对Foc-TR4的拮抗性33
• 3.2 B4蛋白一级序列分析及原核表达33-35
• 3.3 B4蛋白体外拮抗尖孢镰刀菌35-36
• 3.4 B4蛋白的体内细胞定位36-38
• 3.5 蛋白B4赋予转基因番茄对尖孢镰刀菌Fol的抗性38
• 3.6 B4GFP转基因番茄与野生型番茄的差异表达谱及RT-qPCR验证38-43
• 4 讨论43-47
• 第二章 鲍血篮蛋白抗菌肽对细菌的抑制分析47-71
• 1 前言47-59
• 1.1 软体动物血蓝蛋白的结构特征及其功能47-51
• 1.2 鲍血蓝蛋白应答病原物侵染的先天性免疫51-57
• 1.3 三维重构技术简介57-59
• 1.3.1 中央截面定理57-58
• 1.3.2 cryo-EM三维重构的方法及流程58-59
• 2 材料与方法59-61
• 2.1 材料与试剂59
• 2.1.1 多肽和测试菌株59
• 2.1.2 试剂59
• 2.2 实验方法59-61
• 2.2.1 多肽的合成及溶解59
• 2.2.2 血蓝蛋白功能体FU-E的生信预测及序列比对59-60
• 2.2.3 FU-E的3D结构同源模建60
• 2.2.4 抗菌分析60-61
• 3 结果与分析61-68
• 3.1 血蓝蛋白功能体FU-E候选抗菌肽的保守性分析61-62
• 3.2 Haliotisin的抗菌活性分析62-65
• 3.3 Haliotisin结构分析65-68
• 4 讨论68-71
• 全文总结与展望71-73
• 参考文献73-81
• 致谢81-82
• 已发表(或接受发表)的相关论文82

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本文编号：254207