半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）免疫相关基因HMGB2和IFIT1功能研究

发布时间：2017-03-20 04:09

  本文关键词：半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）免疫相关基因HMGB2和IFIT1功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本研究从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆了两个免疫相关基因HMGB2(high-mobility group protein B2)和IFIT1(i nterferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1),命名为CsHMGB2和CsIFIT1,并研究了它们的表达模式以及在宿主抵抗病原感染过程中的作用。在哺乳动物中,高速泳动族蛋白(HMG)已知有多种不同的功能,而在鱼类中HMG相关的研究较少。本研究中,我们从半滑舌鳎cDNA文库中克隆到了HMGB家族的一个基因,CsHMGB2,并研究其生物学功能。CsHMGB2蛋白共有245个氨基酸残基,两个HMG结构域和一个由23个天冬氨酸/谷氨酸残基组成的酸性羧基尾部。荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)实验结果表明CsHMGB2在多个组织表达,并且其表达在病毒或细菌后显著上调。体外细胞实验发现,重组蛋白rCsHMGB2和缺失了C端酸性氨基酸区域的突变型重组蛋白rCsHMGB2M都能显著提高半滑舌鳎外周血淋巴细胞(PBL)抵抗细菌侵染的能力。qRT-PCR分析发现rCsHMGB2显著增强PBL中多种细胞因子和趋化因子的表达。体内实验表明,rCsHMGB2显著抑制病原在半滑舌鳎脾脏和肾脏中的侵染。上述实验结果表明,CsHMGB2具有免疫调节功能和抗病原感染作用,并且这种能力与其酸性羧基端无关。干扰素诱导基因IFIT在哺乳动物免疫系统中具有抗病毒功能,而在鱼类中的功能仍然未知。在本研究中,我们从半滑舌鳎cDNA文库中克隆到了IFIT家族的一个基因,CsIFIT1,并研究了它的抗病毒感染的活性。CsIFIT1由436个氨基酸残基组成,与其它鱼类IFIT蛋白的序列相似度介于30.9%和58.7%之间。软件分析鉴定出两个TPR(tetratricopeptide repeats)结构域。qRT-PCR实验表明,Cs IFIT1的表达在免疫相关的器官组织中最高,并且在鱼体感染肿大细胞病毒后明显上调。在半滑舌鳎中过量表达CsIFIT1可以显著抑制肿大细胞病毒在鱼体中的复制。同样,使用RNA干扰技术降低CsIFIT1表达后,病毒在组织中的复制量显著增高。这些结果表明,Cs IFIT1在鱼类抗病毒免疫中起关键作用。
【关键词】：半滑舌鳎 high-mobility group protein interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 抗细菌感染 抗病毒感染
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S943
【目录】：

• 致谢4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 绪论11-21
• 1.1 鱼类病害及先天免疫相关基因11-16
• 1.1.1 凝集素11-12
• 1.1.2 溶菌酶12
• 1.1.3 抗菌肽12-13
• 1.1.4 补体分子13
• 1.1.5 Toll样受体13-14
• 1.1.6 干扰素14
• 1.1.7 趋化因子14-16
• 1.2 半滑舌鳎HMGB2基因和IFIT1基因16-19
• 1.2.1 HMGB2基因16-18
• 1.2.2 IFIT1基因18-19
• 1.3 研究目的及意义19-21
• 第二章 半滑舌鳎稳定内参筛选21-35
• 2.1 材料和方法21-26
• 2.1.1 实验用鱼21
• 2.1.2 实验用菌株21
• 2.1.3 病原侵染和组织收集21-22
• 2.1.4 mRNA提取及cDNA合成22-23
• 2.1.5 荧光定量PCR引物设计23-25
• 2.1.6 PCR扩增效率25
• 2.1.7 qRT-PCR25
• 2.1.8 数据分析25-26
• 2.2 结果和讨论26-35
• 2.2.1 PCR引物扩增效率26
• 2.2.2 正常生理条件下候选内参基因的表达26-27
• 2.2.3 E．tarda感染对候选内参基因表达的影响27-29
• 2.2.4 病毒感染对候选内参基因表达的影响29-32
• 2.2.5 讨论32-35
• 第三章 半滑舌鳎HMGB2功能研究35-57
• 3.1 材料和方法35-43
• 3.1.1 实验用菌株及受态菌制备35
• 3.1.2 CsHMGB2序列克隆35-36
• 3.1.3 序列分析36
• 3.1.4 CsHMGB2在正常组织中的表达36-37
• 3.1.5 CsHMGB2在鱼体感染病原后的差异表达37
• 3.1.6 CsHMGB2表达载体构建37-38
• 3.1.7 CsHMGB2活性重组蛋白表达及纯化38-40
• 3.1.8 半滑舌鳎外周血淋巴细胞的提取40-41
• 3.1.9 细菌刺激PBL后Cs HMGB2的差异表达41
• 3.1.10 重组蛋白rCsHMGB2对PBL免疫相关基因表达影响41
• 3.1.11 重组蛋白rCsHMGB2和rCsHMGB2M对PBL抗细菌感染能力的影响41-42
• 3.1.12 rCsHMGB2和rCsHMGB2M对鱼体影响42-43
• 3.2 结果和讨论43-57
• 3.2.1 CsHMGB2序列分析43-46
• 3.2.2 CsHMGB2正常组织中的表达差异46-47
• 3.2.3 CsHMGB2在鱼体感染病原后的差异表达47-48
• 3.2.4 CsHMGB2活性蛋白表达及纯化48-49
• 3.2.5 细菌感染对CsHMGB2在PBL中表达的影响49-50
• 3.2.6 重组蛋白rCs HMGB2对PBL免疫相关基因表达影响50-51
• 3.2.7 重组蛋白rCs HMGB2和rCsHMGB2M对PBL抗细菌感染能力的影响51-52
• 3.2.8 rCsHMGB2和rCsHMGB2M对鱼体影响52-54
• 3.2.9 讨论54-57
• 第四章 半滑舌鳎IFIT1功能研究57-74
• 4.1 材料和方法57-62
• 4.1.1 CsIFIT1序列克隆57
• 4.1.2 序列分析57
• 4.1.3 CsIFIT1在正常组织中的表达差异57-58
• 4.1.4 CsIFIT1在鱼体感染病毒后的表达变化58
• 4.1.5 CsIFIT1过量表达质粒构建58-59
• 4.1.6 无内毒素质粒大量提取59
• 4.1.7 CsIFIT1在鱼体过量表达实验59-60
• 4.1.8 过量表达CsIFIT1对半滑舌鳎抗病毒侵染能力的影响60-61
• 4.1.9 鱼体水平RNA干扰Cs IFIT1实验61
• 4.1.10 RNA干扰CsIFIT1对半滑舌鳎抗病毒侵染能力的影响61-62
• 4.2 结果和讨论62-74
• 4.2.1 CsIFIT1序列分析62-64
• 4.2.2 CsIFIT1正常组织中的表达差异64-65
• 4.2.3 CsIFIT1在鱼体感染病毒后的表达变化65-66
• 4.2.4 过量表达CsIFIT1后组织中质粒DNA及质粒来源mRNA的检测66-67
• 4.2.5 过量表达CsIFIT1后对半滑舌鳎抵抗病毒侵染能力的影响67-68
• 4.2.6 RNA干扰效率检测68-69
• 4.2.7 RNA干扰CsIFIT1对半滑舌鳎抗病毒侵染能力的影响69-71
• 4.2.8 讨论71-74
• 结论74-76
• 参考文献76-90
• 附录90-95
• 发表论文与研究成果95

【共引文献】

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