苏云金芽胞杆菌Cry51Aa1杀虫晶体蛋白结构及功能研究

发布时间：2017-03-20 07:02

  本文关键词：苏云金芽胞杆菌Cry51Aa1杀虫晶体蛋白结构及功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：1991年首例Cry3Aa蛋白结构成功解析以来,苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白结构生物学研究的不断深入,有力地推动了蛋白作用机制等研究领域的快速发展,促进了苏云金芽胞杆菌在农林业中更加广泛的应用。为了进一步揭示新型杀虫晶体蛋白的结构,探索杀虫蛋白的作用机理,扩大苏云金芽胞杆菌的应用范围,缓解与防治田间害虫中出现的抗性,本研究以我室新克隆表达的Cry51Aa1蛋白为对象,利用X射线晶体学衍射技术,较全面而深入地开展了结构及功能的探索。结果如下:1.解析出与经典三结构域型Cry蛋白不同,且对马铃薯甲虫幼虫有特异性毒性的Cry51Aa1全长蛋白结构。创建了苏云金芽胞杆菌新颖蛋白结构与杀虫活性之间的新型关系,此项研究国内尚未见诸报道。同时,将已解析的苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白结构的分辨率刷新至1.65?。2.Cry51Aa1蛋白结构主要由β折叠股组成,按结构特性可分为三个结构域:结构域I位于整个结构的氨基端,由α螺旋、310螺旋和β折叠股组成;结构域II位于整个结构的中段,由β发卡和β片层构成;结构域III位于整个结构的羧基端,含有两个β片层。结构域II和结构域III均呈‘β三明治’构象。3.Cry51Aa1蛋白三个结构域具有其自身的特点:结构域I富含芳香族氨基酸,可能与受体结合以及结构稳定性相关;结构域II富含色氨酸与苏氨酸,并含有一个两亲性β发卡结构和一段甘氨酸loop,这些模块可能参与蛋白的多聚和跨膜穿孔过程;结构域III含有完整的羧基尾端,与蛋白酶酶解活化过程紧密联系。4.Cry51Aa1在非对称单元内以单体形式存在,但在晶体与溶液中呈晶体学二聚体状态。对结构进一步分析表明,Cry51Aa1蛋白经胰蛋白酶酶解活化后,二聚体内分子间氢键被破坏,二聚体裂解形成单体,单体聚集产生六聚体,六聚体可能是蛋白与细胞膜相互作用时的多聚形态。酶解亦会破坏蛋白单体内各结构域之间的氢键,从而影响两亲性β发卡结构的稳定性。5.本研究根据螺旋和β折叠组成及分布特点的相似性,三维结构空间分布相似性、以及典型的两亲性β发卡结构特征,将Cry51Aa1蛋白归类于Aerolysin型β穿孔蛋白家族中。同时,比较了Cry51Aa1蛋白单体三结构域与Aerolysin型β穿孔蛋白家族成员结构的异同。6.功能性实验初步表明,Cry51Aa1蛋白对马铃薯甲虫幼虫有较高的杀虫活性。对鞘翅目昆虫的活性实验验证了Cry51A类蛋白的杀虫谱,使之成为结构新颖、且对鞘翅目有特异性杀虫活性的一类苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白;对冈比亚按蚊幼虫细胞系的毒性测定发现,经酶解Cry51Aa1蛋白处理的细胞出现气球样变的现象,说明蛋白能影响细胞膜的完整性,即活化后的Cry51Aa1蛋白具有溶细胞活性。本研究利用结构生物学研究手段,摸索并提炼出了一套适用于苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白表达体系的蛋白纯化、结晶、X射线衍射、结构解析的完整技术路线。结构新颖的Cry51Aa1杀虫晶体蛋白为苏云金芽胞杆菌结构生物学的研究增添了新的成员,也提供了新的研究思路;功能性结果验证并拓宽了Cry51Aa类蛋白的功能范围,不仅证实了Cry51A类蛋白与鞘翅目和半翅目昆虫细胞膜之间存在特异的相互作用,也暗示了该类蛋白在昆虫细胞膜上的作用方式可能与Aerolsyin型β穿孔蛋白家族类似。对Cry51Aa1杀虫晶体蛋白结构的深入研究和分析,为今后进一步阐明Cry51A类蛋白结构与功能的关系、作用机理的研究,以及害虫生物防治奠定了一定的基础。本文在阐述Cry51Aa1杀虫晶体蛋白结构及功能研究之前,对目前苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白结构与功能的研究进展情况作了一个较为详尽的综述。综述着力分析、归纳和总结了苏云金芽胞杆菌三类不同结构特征晶体蛋白的特点;比较分析了相似蛋白结构与相应功能的异同;探索了杀虫晶体蛋白的作用机制,为Cry51Aa1蛋白结构与功能的研究提供了思路和经验。同时,为凸显现代结构生物学的特点,本论文对蛋白质的X射线晶体学基本概念与研究方法也进行了简要概述。
【关键词】：苏云金芽胞杆菌 杀虫晶体蛋白 蛋白结构及功能 X射线衍射 杀虫活性 细胞毒性
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S476.1
【目录】：

• 摘要9-11
• Abstract11-14
• 缩略语表14-16
• 第一章前言16-66
• 1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白结构与功能研究进展16-49
• 1.1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的概述16-18
• 1.2 苏云金芽胞杆菌三结构域型Cry晶体蛋白结构与功能研究18-33
• 1.2.1 三结构域型Cry晶体蛋白的结构特征与功能21-28
• 1.2.1.1 结构域I的结构特征与功能21-23
• 1.2.1.2 结构域II的结构特征与功能23-25
• 1.2.1.3 结构域III的结构特征与功能25-28
• 1.2.2 Parasporin家族中三结构域型Cry晶体蛋白28
• 1.2.3 三结构域型Cry晶体蛋白与结构类似蛋白的比较与分析28-30
• 1.2.4 三结构域型Cry晶体蛋白作用机制研究进展30-33
• 1.2.4.1 穿孔模型30-32
• 1.2.4.2 信号传导模型32-33
• 1.3 苏云金芽胞杆菌Cyt型晶体蛋白结构与功能研究33-37
• 1.3.1 Cyt型晶体蛋白结构概述33-34
• 1.3.2 Cyt型晶体蛋白与结构类似蛋白的比较与分析34-35
• 1.3.3 Cyt型晶体蛋白作用机制35-36
• 1.3.4 Cyt与Cry晶体蛋白协同作用机制36-37
• 1.4 苏云金芽胞杆菌Parasporin型晶体蛋白结构与功能研究37-46
• 1.4.1 Parasporin蛋白的概述与分类37-39
• 1.4.1.1 Parasporin-137-38
• 1.4.1.2 Parasporin-238
• 1.4.1.3 Parasporin-338-39
• 1.4.1.4 Parasporin-439
• 1.4.1.5 其他类Parasporin蛋白39
• 1.4.2 Aerolysin型Parasporin晶体蛋白的结构研究39-41
• 1.4.2.1 结构域I的结构特点和功能40
• 1.4.2.2 结构域II的结构特点和功能40-41
• 1.4.2.3 结构域III的结构特点和功能41
• 1.4.3 Parasporin晶体蛋白与Aerolysin型穿孔蛋白家族的结构比较41-45
• 1.4.3.1 差异最大结构域的比较与分析41-44
• 1.4.3.2 穿孔结构域的比较与分析44-45
• 1.4.4 Aerolysin型穿孔蛋白家族的穿孔作用机制45-46
• 1.5 小结46-49
• 2 蛋白质的X射线衍射晶体学概述49-64
• 2.1 生物大分子结构研究方法概述49-50
• 2.2 蛋白质的结晶50-55
• 2.2.1 晶体的几何学50-52
• 2.2.2 蛋白质的结晶原理52-53
• 2.2.3 蛋白质晶体的实验室制备53-55
• 2.3 X射线衍射理论概述55-64
• 2.3.1 X射线光源55-58
• 2.3.2 晶体的X射线衍射理论58-61
• 2.3.3 蛋白质晶体的结构解析61-64
• 3 Cry51Aa1杀虫晶体蛋白的研究目的和意义64-66
• 第二章苏云金芽胞杆菌Cry51Aa1杀虫晶体蛋白的结构研究66-128
• 1 引言66
• 2 材料与方法66-73
• 2.1 实验材料66-69
• 2.1.1 菌株66-67
• 2.1.2 培养基和抗生素67
• 2.1.3 试剂和仪器67-69
• 2.1.3.1 试剂67-68
• 2.1.3.2 仪器和材料68-69
• 2.2 实验方法69-73
• 2.2.1 菌株及培养69
• 2.2.2 菌体收集和碱溶处理69-70
• 2.2.3 SDS-PAGE电泳70-71
• 2.2.4 蛋白纯化71
• 2.2.5 BCA蛋白浓度测定71
• 2.2.6 蛋白酶酶解反应71-72
• 2.2.7 晶体的培养72
• 2.2.8 晶体衍射数据收集与结构解析72-73
• 3 结果与讨论73-126
• 3.1 蛋白基本信息的预测和分析73-77
• 3.1.1 一级结构基本信息分析73-74
• 3.1.2 二级结构分析74-75
• 2.1.3 蛋白序列相似性比对75-76
• 2.1.4 三级结构分析76-77
• 3.2 蛋白表达与纯化结果分析77-81
• 3.2.1 蛋白培养与表达77-78
• 3.2.2 蛋白纯化78-81
• 3.2.2.1 阴离子交换层析纯化79-80
• 3.2.2.2 凝胶过滤层析纯化80-81
• 3.3 蛋白浓度的测定与保存81
• 3.4 蛋白酶酶解反应结果81-83
• 3.5 蛋白晶体生长83-95
• 3.5.1 晶体生长条件初筛83-86
• 3.5.2 蛋白纯化方法调整86-87
• 3.5.3 晶体筛选和生长条件再优化87-89
• 3.5.4 母体晶体生长条件优化和衍射参数的确定89-91
• 3.5.5 重原子衍生物培养条件优化和衍射参数的确定91-95
• 3.6 晶体衍射数据收集95-97
• 3.6.1 母体晶体衍射数据收集和分析95-96
• 3.6.2 重原子衍射数据收集和分析96-97
• 3.7 相位信息的确定97-99
• 3.7.1 重原子坐标的寻找97-98
• 3.7.2 相位求解98-99
• 3.8 结构解析99-100
• 3.8.1 结构初步解析与模型搭建99-100
• 3.8.2 分子置换法解析结构100
• 3.9 结构修正100-102
• 3.10蛋白结构注册102
• 3.11结构数据质量统计分析102-104
• 3.12 Cry51Aa1蛋白的单体结构特征104-112
• 3.12.1 结构域I106-108
• 3.12.2 结构域II108-109
• 3.12.3 结构域III109-110
• 3.12.4 单体内部相互作用力110-112
• 3.13 Cry51Aa1蛋白的二聚体结构特征112-116
• 3.13.1 二聚体结构与二聚体内相互作用力112-114
• 3.13.2 二聚体间相互作用力114-115
• 3.13.3 与Aerolysin型穿孔蛋白在晶体/溶液中聚集状态比较115-116
• 3.14分析超速离心法测定蛋白聚集状态116-117
• 3.15羧基端酶解导致Cry51Aa1蛋白由二聚体裂解为单体117-119
• 3.15.1 酶解反应发生在羧基末端117-118
• 3.15.2 羧基端酶解破坏分子间相互作用力118-119
• 3.16结构域I芳香族氨基酸的作用119-121
• 3.17丝氨酸/苏氨酸的作用121-124
• 3.18甘氨酸Loop124-125
• 3.19两亲性发卡结构125-126
• 4 本章小结126-128
• 第三章 苏云金芽胞杆菌Cry51Aa1杀虫晶体蛋白的功能研究128-138
• 1 引言128
• 2 材料与方法128-132
• 2.1 Cry51Aa1杀虫晶体蛋白对马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）幼虫杀虫活性研究128-130
• 2.1.1 蛋白样品的制备128-129
• 2.1.2 马铃薯甲虫幼虫的饲养129
• 2.1.2.1 马铃薯植株的培育129
• 2.1.2.2 马铃薯甲虫幼虫的饲养129
• 2.1.3 对马铃薯甲虫幼虫杀虫活性的生物测定方法129-130
• 2.2 Cry51Aa1杀虫晶体蛋白对冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）Ag55细胞系的毒性研究130-132
• 2.2.1 蛋白样品的制备130
• 2.2.2 冈比亚按蚊Ag55细胞系的培养130-131
• 2.2.2.1 Ag55细胞系130
• 2.2.2.2 培养基与主要实验器材130-131
• 2.2.2.3 细胞系的培养131
• 2.2.3 对冈比亚按蚊Ag55细胞系毒性的测定方法131-132
• 3 结果与讨论132-136
• 3.1 Cry51Aa1杀虫晶体蛋白对马铃薯甲虫幼虫的杀虫活性132-133
• 3.2 Cry51Aa1杀虫晶体蛋白与Cry51Aa2蛋白比较分析133-134
• 3.3 Cry51Aa1杀虫晶体蛋白对冈比亚按蚊Ag55细胞系的溶细胞毒性134-136
• 4 小结136-138
• 第四章总结与展望138-141
• 参考文献141-158
• 已发表的论文158
• 蛋白结构注册158-159
• 致谢159-160

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 吴洪福;郭淑元;李海涛;高继国;;苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白结构和功能研究进展[J];东北农业大学学报;2009年02期

2 蔡峻,任改新;苏云金芽孢杆菌Cyt蛋白研究进展[J];微生物学报;2002年04期

3 郭文超;邓春生;李国清;邓建宇;姜卫华;吴家和;王佩玲;谭万忠;张青文;;我国马铃薯甲虫生物防治技术研究进展[J];新疆农业科学;2011年12期

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