层粘连蛋白受体作为猪瘟病毒吸附受体的鉴定

发布时间：2017-03-20 07:13

  本文关键词：层粘连蛋白受体作为猪瘟病毒吸附受体的鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：病毒是结构简单的微生物,无完整的代谢酶系统,需要借助宿主细胞合成自身物质从而完成自身生命周期。病毒囊膜蛋白与宿主细胞表面成分——细胞受体的相互结合则是一切病毒进入宿主细胞的起始,并决定了病毒感染的种属范围和组织嗜性。尤为重要的是,病毒囊膜蛋白与相应细胞受体的结合位点往往成为开发抗病毒药物的重要靶标。因此,针对病毒受体的研究具有重要的科研和应用价值。猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的烈性传染病。该病对养猪业危害极大,在多个国家均有流行,具有重要的经济意义。近年来,随着对CSFV研究的不断深入,研究者发现了大量与该病毒相互作用的宿主蛋白,并探讨了其机理,但针对CSFV细胞受体的研究尚属空白。迄今,仅有硫酸乙酰肝素(Heparin Sulfate,HS)被鉴定为CSFV的吸附受体。该分子亦广泛分布于CSFV非易感细胞表面,因此,我们推测CSFV一定存在其它尚未发现的细胞受体,并采取一系列方法筛选细胞受体。本研究中,我们利用针对大量猪源膜蛋白基因的小分子干扰RNA来筛选可能参与CSFV感染的膜蛋白。该筛选发现了多个CSFV潜在受体分子。其中,层粘连蛋白受体(Laminin receptor,Lam R)已被鉴定为多种病原体的细胞受体,我们选择该蛋白进行后续研究。激光共聚焦分析显示,该蛋白与CSFV在细胞膜高度共定位。免疫共沉淀试验说明该蛋白与CSFV囊膜糖蛋白Erns存在特异性相互作用。一系列抑制试验显示,抗Lam R蛋白抗体、可溶性Lam R和Laminin蛋白均可显著抑制CSFV的复制,并且该抑制效果呈现剂量依赖性。我们以表达Lam R的慢病毒感染PK-15细胞,构建稳定表达Lam R的细胞系。CSFV在该细胞系的复制水平显著高于对照细胞系。我们利用吸附试验说明Lam R蛋白在CSFV吸附阶段发挥功能,Lam R过表达细胞系较对照细胞系吸附病毒粒子数显著增多。我们进一步探讨了HS与Lam R的关系,结果显示,Lam R蛋白和HS互相协同,帮助病毒吸附。该现象在SK6细胞尤为明显。但Lam R的表达与CSFV的组织嗜性并无明显相关性,而其被沉默后也不影响同属黄病毒科瘟病毒属的BVDV的复制。综上所述,我们利用si RNA文库对重要的猪源膜蛋白基因进行筛选,并通过一系列抑制试验、吸附试验确定Lam R为CSFV的又一吸附受体,该分子与已知受体HS相互协同,帮助CSFV感染。
【关键词】：猪瘟病毒 细胞受体 层粘连蛋白受体 硫酸乙酰肝素
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-10
• 英文缩略表10-11
• 第一章 引言11-24
• 1.1 猪瘟与猪瘟病毒11-12
• 1.1.1 猪瘟11
• 1.1.2 猪瘟病毒11-12
• 1.2 猪瘟病毒的复制和感染机制12-13
• 1.2.1 结构蛋白在CSFV复制中的功能12
• 1.2.2 非结构蛋白在CSFV复制中的功能12-13
• 1.3 病毒的细胞受体研究进展13-19
• 1.3.1 细胞受体13
• 1.3.2 非蛋白类细胞受体的筛选方法13-14
• 1.3.3 蛋白类细胞受体的筛选14-19
• 1.4 猪瘟病毒及黄病毒科病毒细胞受体的研究进展19-22
• 1.4.1 硫酸乙酰肝素19
• 1.4.2 辅膜蛋白CD4619-20
• 1.4.3 低密度脂蛋白受体20-21
• 1.4.4 II型膜联蛋白21
• 1.4.5 猪瘟病毒配体的研究21-22
• 1.5 层粘连蛋白受体22-23
• 1.6 本研究的目的与意义23-24
• 第二章 层粘连蛋白受体作为猪瘟病毒吸附受体的鉴定24-54
• 2.1 材料和方法24-33
• 2.1.1 毒株、细胞和载体24
• 2.1.2 其它实验材料24
• 2.1.3 主要仪器设备24-25
• 2.1.4 试剂配制25
• 2.1.5 siRNA分子的设计25-28
• 2.1.6 干扰分子的转染和指示病毒的感染28
• 2.1.7 Fluc活性检测28-29
• 2.1.8 病毒毒价的测定29
• 2.1.9 流式细胞术29
• 2.1.10慢病毒介导的稳定下调细胞系和上调细胞系的构建29
• 2.1.11细胞活力检测29-30
• 2.1.12激光共聚焦试验30
• 2.1.13细胞膜蛋白的提取30
• 2.1.14免疫共沉淀试验30
• 2.1.15阻断试验30-31
• 2.1.16可溶性蛋白竞争试验31
• 2.1.17 Western blotting检测31
• 2.1.18病毒吸附试验31
• 2.1.19荧光定量RT-PCR31
• 2.1.20受体重建试验31-32
• 2.1.21适宜CSFV复制的细胞系的筛选32
• 2.1.22 CSFV感染率的测定32
• 2.1.23 LamR组织丰度检测32
• 2.1.24 LamR对BVDV复制影响的检测32
• 2.1.25数据分析32-33
• 2.2 结果33-50
• 2.2.1 siRNA筛选结果33
• 2.2.3 LamR沉默效果验证33-34
• 2.2.4 沉默LamR对不同亚型CSFV复制的影响34-36
• 2.2.5 CSFV在稳定下调细胞系中的复制36-38
• 2.2.6 LamR与CSFV共定位情况38
• 2.2.7 LamR与Erns的相互作用38-39
• 2.2.8 可溶性LamR对CSFV复制的抑制作用39-40
• 2.2.9 可溶性Laminin对CSFV复制的抑制作用40-41
• 2.2.10 LamR抗体对CSFV复制的抑制作用41
• 2.2.11 CSFV在稳定表达LamR的CSFV易感细胞中的复制41-43
• 2.2.12 CSFV在稳定表达LamR的CSFV非易感细胞中的复制43-44
• 2.2.13 CSFV在非易感细胞内复制水平检测44-46
• 2.2.14 CSFV对细胞表面LamR的吸附能力46-47
• 2.2.15 CSFV对肝素酶处理细胞的感染率47-49
• 2.2.16 LamR在猪体不同器官丰度检测49
• 2.2.17 LamR不影响BVDV的增殖49-50
• 2.3 讨论50-54
• 第三章 全文结论54-55
• 参考文献55-65
• 致谢65-66
• 个人简历66

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