真菌溶磷相关基因的克隆与功能分析

发布时间：2017-03-21 22:09

  本文关键词：真菌溶磷相关基因的克隆与功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：我国90%以上耕地缺磷,磷肥的使用是解决作物增产问题的重要措施。但长期以来磷肥的过量使用以及土壤固定化间题造成了严重的资源浪费、环境污染。因此开发利用溶磷生物肥料,研究溶磷微生物的溶磷机理及溶磷相关基因,对充分发挥溶磷微生物在农业中的作用具有重要实践价值和理论意义。本文从我国北方高化肥施用土壤中筛选了高效溶磷真菌7株。并且重点对其中3株菌株P4(Penicillium oxalicum)、P93 (Aspergillus aculeatus)以及P85 (Aspergillus niger)的溶磷效果、溶磷条件、分泌有机酸、土壤定植能力、植物促生能力进行研究。数据显示,接种溶磷菌显著提高溶液中的有效磷浓度,降低溶液pH值。菌株P93、P4和P85对磷酸钙的溶解效果最为显著。溶解磷矿粉最适碳源分别是果糖、葡萄糖和麦芽糖；最适氮源类型分别为尿素、铵态氮及硝态氮。溶磷最适温度都是25-35℃,磷矿粉最适浓度为2 mg/mL。菌株P93主要产生的苹果酸和乙酸；P4主要产生的酒石酸和柠檬酸；P85则主要产生的苹果酸和柠檬酸。盆栽条件下,施用菌剂对不同磷源处理土壤中玉米生物量影响显著。溶磷菌剂P93、P4和P85分别在以磷酸钙、磷酸钙和昆阳磷矿粉为磷源条件下的促生效果最好。溶磷真菌在土壤中定殖能力差异显著,顺序为P93P85P4。施加磷矿粉有利于溶磷菌的定殖。菌剂P93增加土壤有效磷、有机酸浓度最为显著。添加磷源与种植植物都能增加土壤有机酸浓度。小区试验中,菌剂的施加能够显著增加玉米产量,最高增产1.22 t/hm2。与对照相比,3种菌剂分别增产15.6%(P93)、15.3%(P4)和12.6%(P85)。根据以上实验结果,选择菌株P93为出发菌,利用PCR-DGGE方法研究菌剂P93的施加对土壤微生物多样性的影响。结果表明,接种溶磷菌剂P93能够显著增加玉米根际微生物多样性。本研究构建了溶磷真菌P93的λ噬菌体cDNA文库以及pBluescript SK(+)功能文库。λ噬菌体文库滴度为4.9×109 pfu/mL,功能文库库容量为6.88×106 cfu/mL,重组率为99.58%。从文库中筛选到了溶磷相关基因psf-Yo该序列经鉴定为谷氨酸脱氢酶基因且具有一个明显的开放阅读框,编码蛋白含有460个氨基酸残基,具有两个主要结构域,分别为Glu/a-酮戊二酸结合位点基序和NADP辅酶结合位点基序。液体条件下,携带有该基因的克隆子能够在显著降低培养基pH值,同时提高有效磷浓度,并且可分泌9种目标有机酸。利用hpRNA表达载体对菌株P93的psf-Y基因沉默。平板上转化菌的溶磷效果受氮源浓度影响显著。液体中溶磷能力显著降低。半定量RT-PCR结果显示,野生型菌株psf-Y基因表达量显著高于转化型菌株。以克隆得到的根特异表达启动子基因pykl0以及psf-Y基因构建了植物表达载体pC-pyk-psf,并且通过农杆菌介导转化拟南芥。GUS基因表达检测、PCR以及RT-PCR验证外源基因已经整合到了拟南芥基因组中,并在转录水平上表达。缺磷培养下,转基因株系根长、茎长及平均鲜重虽高于野生型,但并不显著。然而全磷浓度显著高于野生型。正常磷培养下,转基因株系生物量显著高于野生型,但全磷浓度较野生型无显著差异。定量RT-PCR检测psf-Y基因表达量,转基因株系在缺磷条件下的表达量显著高于正常磷培养条件。
【关键词】：溶磷真菌 溶磷效果 溶磷相关基因 基因沉默 转基因拟南芥
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S154.3
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 英文缩略表11-12
• 第一章 引言12-26
• 1.1 我国的磷矿资源12
• 1.1.1 我国的磷矿资源与特点12
• 1.2 土壤中的磷素及其作用12-14
• 1.2.1 土壤中的磷素的形态12-13
• 1.2.2 磷的作用13-14
• 1.3 磷肥的转化与有效性14
• 1.4 溶磷微生物的研究进展14-17
• 1.5 溶磷微生物溶磷机理的研究17-19
• 1.6 溶磷相关基因的克隆与功能分析19-21
• 1.7 转基因技术在农业生产中的研究进展21-24
• 1.8 研究目的、意义及研究内容24-25
• 1.8.1 研究目的和意义24
• 1.8.2 研究内容24-25
• 1.9 技术路线25-26
• 第二章 材料与方法26-47
• 2.1 实验材料26-31
• 2.1.1 土壤样品26
• 2.1.2 试验用土壤与作物种子26
• 2.1.3 磷源26
• 2.1.4 所用菌株、质粒和引物26-29
• 2.1.5 培养基29-30
• 2.1.6 试剂及缓冲液30-31
• 2.1.7 主要仪器31
• 2.2 实验方法31-47
• 2.2.1 溶磷真菌的筛选31
• 2.2.2 溶磷真菌的鉴定31-32
• 2.2.3 溶磷菌液体培养条件下溶磷效果研究32
• 2.2.4 溶磷菌溶磷条件研究32-33
• 2.2.5 液体条件下溶磷菌分泌有机酸测定33
• 2.2.6 液体条件下溶磷菌分泌吲哚乙酸测定33-34
• 2.2.7 溶磷菌温室盆栽环境下溶磷、促生效果研究34
• 2.2.8 溶磷菌田间溶磷、促生效果研究34-35
• 2.2.9 溶磷菌土壤定殖能力测定35
• 2.2.10 溶磷菌土壤环境下分泌有机酸测定35
• 2.2.11 溶磷真菌P93对土壤微生物群落的影响35-37
• 2.2.12 溶磷真菌P93λ噬菌体cDNA文库的构建37-41
• 2.2.13 溶磷相关基因的筛选与生物信息学分析41
• 2.2.14 真菌体内溶磷相关基因psf-Y功能分析41-43
• 2.2.15 psf-Y基因植物表达载体的构建及拟南芥表达43-47
• 第三章 溶磷真菌的分离与筛选47-53
• 3.1 结果与讨论47-52
• 3.1.1 溶磷真菌的筛选47
• 3.1.2 溶磷真菌在平板中的溶磷效果47-49
• 3.1.3 菌株的ITS rRNA基因序列分析49
• 3.1.4 菌株的形态观察49-52
• 3.2 结论52-53
• 第四章 溶磷真菌溶磷效果研究53-63
• 4.1 结果与讨论53-61
• 4.1.1 溶磷菌对难溶磷酸盐及磷矿粉的测定53-56
• 4.1.2 碳源对溶磷菌溶磷效果的影响56
• 4.1.3 氮源对溶磷菌溶磷效果的影响56-57
• 4.1.4 温度对溶磷菌溶磷效果的影响57
• 4.1.5 磷矿粉的量对溶磷效果的影响测定57-58
• 4.1.6 高效液相色谱法测定有机酸浓度58-61
• 4.2 结论61-63
• 第五章 溶磷真菌土壤溶磷、促生效果及生态效应研究63-76
• 5.1 结果与讨论63-74
• 5.1.1 盆栽条件下溶磷菌对玉米生长的影响63
• 5.1.2 盆栽条件下溶磷菌对土壤有效磷的影响63-64
• 5.1.3 盆栽条件下溶磷菌植株全磷的影响64
• 5.1.4 盆栽条件下溶磷菌土壤定殖能力64-66
• 5.1.5 溶磷菌对土壤有机酸浓度的影响66-67
• 5.1.6 小区试验中溶磷菌剂对玉米促生和产量的影响67-69
• 5.1.7 小区试验中溶磷菌剂对玉米和土壤磷素的影响69-70
• 5.1.8 溶磷菌剂对玉米根际土壤微生物群落结构和多样性的影响70-74
• 5.2 小结74-76
• 第六章 菌株P93 CDNA文库构建及溶磷相关基因的筛选76-86
• 6.1 结果与讨论76-85
• 6.1.1 溶磷真菌P93 cDNA文库的构建76-77
• 6.1.2 溶磷相关基因的筛选和生物信息学分析77-82
• 6.1.3 携带基因psf-Y克隆子对溶液pH值以及可溶磷的影响82-83
• 6.1.4 携带基因psf-Y克隆子有机酸分泌情况测定83-85
• 6.2 结论85-86
• 第七章 溶磷相关基因PSF-Y的功能分析86-100
• 7.1 结果与讨论86-98
• 7.1.1 psf-Y基因沉默质粒pSi-psf::hyg的构建86-87
• 7.1.2 棘孢曲霉P93原生质体的制备87-88
• 7.1.3 PEG转化棘孢曲霉P93原生质体88-89
• 7.1.4 野生型菌株与转化菌株形态学观察和溶磷能力89-92
• 7.1.5 拟南芥根特异启动子和磷转运蛋白基因的克隆92
• 7.1.6 表达载体的构建92-94
• 7.1.7 pC-pyk-psf转化拟南芥及分子检测94-95
• 7.1.8 转基因拟南芥种植试验95-98
• 7.2 结论98-100
• 第八章 全文结论100-103
• 参考文献103-120
• 附录120-123
• 致谢123-124
• 作者简历124

【参考文献】

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本文编号：260392