莲花瓣类黄酮色素分析及莲花瓣着色机理研究

发布时间：2017-03-22 00:09

  本文关键词：莲花瓣类黄酮色素分析及莲花瓣着色机理研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：莲是莲科莲属的一种古老的多年生水生草本花卉,具有很高的观赏价值,其中花色是其重要的观赏元素之一,并决定着莲的观赏价值。莲属植物有两个种：莲(N. nucifera Gaertn)和美洲黄莲(N. lutea Pers)。其中美洲黄莲的花只有黄色系,而莲的花具有红色、粉红色、白色和红/白间色等色系。目前对莲花色的研究鲜有报道。为了评价不同类黄酮色素对莲的花色这一性状的贡献以及揭示引起莲红、白花色差异的机理,本研究首先采用高效液相色谱—质谱联用仪(HPLC-MS)对108种包含红、粉红、黄、白和红/白间色五种花色的莲种质资源品种的花瓣中的类黄酮类色素成分(包括花青素、黄酮和黄酮醇)进行分离和定性、定量分析。然后选取了开红花的‘野红莲’和开白花的‘白鸽’两种莲品种的花瓣为材料,进行比较蛋白质组学分析,并结合两个品种花瓣中的类黄酮色素积累情况、花青素途径上结构基因转录水平的分析、候选基因的编码区及启动子区的序列分析以及其启动子区的甲基化水平分析,得出以下结果：(1)在莲的种质资源品种的花瓣中共检测到5种花青素,分别为：飞燕草色素3-O-葡萄糖苷(Dp-3-glu)、矢车菊素3-O-葡萄糖苷(Cy-3-glu)矮牵牛色素3-O-葡萄糖苷(Pt-3-glu)、芍药色素3-O-葡萄糖苷(Pn-3-glu)和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷(Mv-3-glu),以及14种黄酮和黄酮醇,分别为：杨梅黄酮3-O-半乳糖苷(Myr-3-Gal)、杨梅黄酮3-O-葡萄糖苷(Myr-3-Glu)、槲皮素-3-阿拉伯呋喃糖(1→2)-半乳糖吡喃糖苷(Qc-3-Ara-Gal)、杨梅黄酮-3-葡糖糖醛酸酯(Myr-3-Gln)、芦丁(rutin)、金丝桃苷(hyperoside)、异槲皮苷(isoquercitrin)、槲皮素3-O-葡萄糖苷酸(Qc-3-Gln)、异鼠李素3-O芦丁糖苷(Iso-3-Rut)、山奈酚3-O-半乳糖苷(Kae-3-Gal)、黄芪苷(astragalin)、异槲皮素3-O-葡萄糖苷(Iso-3-Glu)、山奈酚3-O-葡萄糖苷酸(Kae-3-Gln)和异槲皮素3-O-葡萄糖苷酸(Iso-3-Gln)。而根据苷元的不同,黄酮和黄酮醇可以分为四大类,分别为杨梅黄酮衍生物(Myr-D)、槲皮素衍生物(Qc-D)、山奈酚衍生物(Kae-D)以及异鼠李素衍生物(Iso-D)。(2)一般情况下,黄色和白色品种的花瓣中几乎检测不到花青素,少数的红/白间色品种的花瓣中只能检测到少量的两到三种花青素。几乎所有的红色和粉红色花瓣中都能检测到五种花青素,并且红色花瓣中的含量要比粉红色的高。在五种花青素中,Mv-3-glu和Dp-3-glu含量较高。除了黄色品种外,其它4种花色的品种中的黄酮和黄酮醇中都是Kae-D的含量最高,而在黄色品种中则是Iso-D的含量最高。(3)选取两种莲品种——‘野红莲’(红花)和‘白鸽’(白花)作为代表品种,首先经过HPLC-MS分析,在‘野红莲’花瓣中鉴定到5种花青素和14种黄酮和黄酮醇,而在‘白鸽’的花瓣中未检测到任何花青素成分,鉴定到13种黄酮和黄酮醇。原花青素检测实验表明‘野红莲’和‘白鸽’的花瓣中都含有原花青素(PA)。然后对两者花瓣的横切面进行了光学显微镜观察,发现在‘野红莲’花瓣上表皮细胞中有红色色素的积累,而在‘白鸽’的花瓣中未观察到色素的积累。(4)对‘野红莲’和‘白鸽’的花瓣进行了比较蛋白质组学分析,共鉴定到88个差异表达蛋白质,其中36个在‘野红莲’中表达量较高,52个在‘野红莲’中表达量较低。在所有鉴定到的蛋白质中包含4个是参与花青素途径的酶,分别为：黄烷酮3-羟化酶(F3H)、花青素合酶(ANS)、花青素3-o-葡萄糖苷转移酶(UFGT)以及谷胱甘肽S-转移酶(GST)。其中F3H和UFGT的表达量在‘白鸽’中较高：而ANS和GST在‘野红莲’中的表达量较高。(5)对花青素途径上结构基因的转录水平进行了分析,其中查尔酮合成酶基因(CHS)、黄烷酮3’-羟化酶基因(F3'H)、F3H和UFGT在‘白鸽’中的转录水平较高；而查尔酮异构酶基因(CHI)、黄烷酮3'5'-羟化酶(F3'5'H)、二氢黄酮醇还原酶基因(DFR)、ANS和GST在‘野红莲’中的转录水平较高。F3H和UFGT的转录水平与其编码的蛋白质的表达水平是一致的,都是‘白鸽’中的表达水平比‘野红莲’中的高；ANS和GST这两个基因的转录水平与其编码的蛋白质的表达水平也是一致的,都是‘野红莲’中的表达水平较高。(6)对ANS基因的开放阅读框(ORF)及2000 bp左右的启动子区序列在‘野红莲’和‘白鸽’花瓣中进行了克隆分析,结果显示两个品种之间无序列差异,但是两者花瓣的ANS基因启动子区的甲基化位点和甲基化水平都存在差异。‘白鸽’要比‘野红莲’的甲基化位点多出18处(包括14处CG,2处CHH和2处CHG),总体的甲基化水平也比‘野红莲’高。由上述结果,推测出以下结论：(1)莲花瓣的红色是由花青素决定的,且花青素总含量越高,红色越深。异鼠李素衍生物(Iso-D)可能与莲花瓣的黄色有一定的相关性,这也是莲与美洲黄莲中类黄酮色素分布的差异。(2) ‘野红莲’和‘白鸽’的红、白花色差异可能是由于红、白莲花瓣中的AMS 启动子区不同水平的甲基化而影响了其与转录因子的结合,进而影响了ANS 的表达水平以及花青素的积累,从而导致了红、白莲花的着色差异。本课题的研究对莲种质资源品种的花瓣中的类黄酮色素进行了评价并对莲红、白花瓣的着色机理提出了新的观点,可能有助于以后莲新花色的分子育种。
【关键词】：莲 色素 高效液相色谱色谱联用仪 蛋白质组学 甲基化
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(武汉植物园)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S682.32
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 1 引言13-33
• 1.1 莲的分类、分布、历史及用途13-17
• 1.2 莲的研究现状17-19
• 1.3 花着色研究及类黄酮代谢途径的研究现状19-28
• 1.3.1 决定花色的因素——色素19-20
• 1.3.2 植物中类黄酮类色素的特征20-22
• 1.3.3 植物花朵的着色机理和类黄酮生物合成途径的研究进展22-27
• 1.3.4 莲组织中类黄酮物质的研究进展27-28
• 1.4 蛋白质组学的研究进展28-30
• 1.5 DNA甲基化的研究进展30-32
• 1.6 本课题的研究目标和意义32-33
• 2. 材料与方法33-49
• 2.1 实验材料33
• 2.2 化学试剂及配制33-35
• 2.3 花青素、黄酮和黄酮醇的提取35-36
• 2.4 花青素、黄酮和黄酮醇的高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析36
• 2.5 显微镜观察荷花花瓣横切面36-37
• 2.6 荷花花瓣中原花青素的分析37
• 2.7 蛋白质的提取和定量分析37-38
• 2.8 蛋白质双向电泳38-39
• 2.9 蛋白质差异表达分析及质谱鉴定39-41
• 2.10 蛋白质功能分类以及KEGG代谢途径分析41
• 2.11 RNA的提取和qRT-PCR分析41-43
• 2.12 DNA的提取及两个莲品种的ANS基因及其启动子区的序列分析43-47
• 2.13 两个莲品种花瓣的ANS基因2Kb启动子区序列的甲基化水平分析47-48
• 2.14 数据分析48-49
• 3 结果与分析49-73
• 3.1 HPLC-MS分析方法的验证49
• 3.2 花青素、黄酮和黄酮醇的鉴定49-52
• 3.3 不同荷花品种花瓣中花青素、黄酮和黄酮醇成分和含量的分析52-54
• 3.4 主成分分析54-56
• 3.5 红、白两种不同花色的莲品种花瓣中色素的分析56-61
• 3.6 红、白两种不同花色的莲品种花瓣的比较蛋白质组学分析61-65
• 3.7 荷花花瓣中参与花青素生物合成与积累的差异表达蛋白65-68
• 3.8 ‘野红莲’和‘白鸽’花瓣中的ANS基因的启动子区的序列分析以及启动子区的甲基化水平的分析68-73
• 4 讨论73-79
• 4.1 莲的类黄酮代谢途径的推断73-75
• 4.2 红、白莲花瓣中的花青素途径的结构基因的表达分析75-76
• 4.3 莲花瓣中花青素途径的调控机制76-79
• 5 结论79-81
• 参考文献81-95
• 附录A95-99
• 附录B99-105
• 附录C105-107
• 附录D107-109
• 附录E109-121
• 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果121-123
• 致谢123-124

【参考文献】

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本文编号：260533