基于光子晶体编码微球的农药多残留检测技术构建与应用

发布时间：2017-03-22 17:10

  本文关键词：基于光子晶体编码微球的农药多残留检测技术构建与应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的：我国是农药生产与消费大国,随着农药的大量和不合理地使用,农药残留对人类健康、生态环境以及对外贸易造成的负面影响渐渐显露出来,农药残留通过各种可能的途径危及食品安全、人畜安全以及生态环境等问题备受关注。农业生产中广泛应用的农药通过沉降、地表径流等途径进入环境,引起水资源污染、水生态系统破坏、食品安全等一系列问题。因此,为了保护人们的健康以及控制农药对环境的污染,发展灵敏、快速以及成本低的农药定量检测技术是非常必要的。经典的农药残留仪器检测方法包括HPLC、GC-MS、LC-MS等,虽然这些方法灵敏、可靠,但是存在仪器昂贵、需要专业的技术人员操作、样品前处理复杂、耗时长等缺点,而且检测过程中大量有机溶剂的使用可能引起环境污染,因此其应用受到了一定的限制。快速检测技术是监控农药残留的有效手段,基于免疫分析的农药残留检测技术具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强、检测费用低等优点,是当前国内外农药残留快速检测的研究热点,可以实现对农药残留的快速检测。但是,国内外现有的研究主要集中于针对单一农药建立特异性的免疫分析方法,而实际样品中普遍同时存在多种农药,建立同时检测多种农药的检测方法是拟解决的关键问题。与单一分析物检测方法相比,以编码微球作为载体的液相芯片技术具有高通量、检测时间短、样品用量少、检测效率高、成本低以及可以进行多种分析物的同时检测等优点。因此,本研究将液相芯片技术应用于农药残留检测领域,以胶体光子晶体微球和光子晶体水凝胶复合微球作为编码微载体,以有机磷农药和氨基甲酸酯类农药作为分析对象,建立了基于胶体光子晶体微球同时检测杀螟硫磷和甲基毒死蜱的液相芯片技术和基于光子晶体水凝胶复合微球同时检测五种有机磷农药和氨基甲酸酯类农药(杀螟硫磷、甲基毒死蜱、倍硫磷、甲萘威和速灭威)的液相芯片技术,为相关技术的应用奠定了基础。研究内容和结果：(1)胶体光子晶体微球的制备利用协流式玻璃微流控平台,使用不同粒径的二氧化硅纳米粒子制备具有不同反射光谱的胶体光子晶体微球,为后续的农药多残留液相芯片检测技术提供编码载体。(2)基于胶体光子晶体微球同时检测杀螟硫磷和甲基毒死蜱的液相芯片技术通过将农药单克隆抗体偶联于胶体光子晶体微球表面作为检测探针,加入待检的游离农药和异硫氰酸荧光素标记的农药抗原,采用直接竞争法,在液相反应体系中游离的农药和异硫氰酸荧光素标记的农药抗原共同竞争微球上各自特异性的农药单克隆抗体,待测农药含量越少,结合到微球表面抗体上的农药抗原越多,检测时的荧光强度越高；反之,待测农药含量越多,结合到微球表面抗体上的农药抗原越少,检测时的荧光强度越低。根据荧光强度与待检农药的浓度呈一定的相关性,因此可定量检测农药。经过条件优化后,绘制了同时检测甲基毒死蜱和杀螟硫磷的标准曲线,线性检测范围分别为0.40～735.37 ng/mL和0.25-1024ng/mL,最低检测限分别为0.25 ng/mL和0.40 ng/mL。以毒死蜱、对硫磷、甲基对硫磷、三唑磷、杀扑磷、溴硫磷、三氯吡啶酚、倍硫磷、对氧磷、氯硫磷进行交叉反应实验,交叉反应率均小于5%,该方法对各种干扰物无明显交叉反应,特异性良好。添加杀螟硫磷和甲基毒死蜱于空白的葡萄、莴笋以及白菜样品中,平均添加回收率范围分别为81.6%-92.2%和82.4%～97.3%。实验结果表明,该方法对杀螟硫磷和甲基毒死蜱的检测具有灵敏度高、特异性强、重现性好、线性范围宽和检测限低等优点,可以为农药残留高通量分析提供了一种快速有效的实用分析方法。(3)基于光子晶体水凝胶复合微球同时检测五种有机磷和氨基甲酸酯类农药的液相芯片技术以胶体光子晶体微球为基础,制备了五种不同反射光谱的光子晶体水凝胶复合微球作为液相芯片的编码微载体。以五种应用广泛的有机磷农药和氨基甲酸酯类农药作为目标分析物,将抗原-抗体免疫反应与生物素-亲和素放大体系相结合应用于农药残留的检测,实现了对五种农药残留同时检测的目标。基于间接竞争免疫反应来构建农药多残留检测方法,偶联在微球上的农药抗原与目标农药竞争结合农药单克隆抗体,由于目标农药可以抑制大分子农药抗原与相应农药抗体的结合,当样品中农药浓度增加时,由于抗原抗体的特异性识别反应,溶液中的抗原抗体免疫复合物增加,而结合到微球表面的抗体减少,形成的免疫复合物相应减少,因此检测时,荧光强度降低。根据荧光强度与待检农药的量成一定的相关性,可以定量检测农药。通过一系列的优化和筛选实验条件(抗原、抗体加入量、反应时间等),进一步的提高了液相芯片检测技术的灵敏度以及稳定性。该方法检测杀螟硫磷、甲基毒死蜱、倍硫磷、甲萘威和速灭威的最低检测限分别为0.02ng/mL、0.012 ng/mL、0.04 ng/mL、0.05 ng/mL和0.10ng/mL,线性检测范围分别为0.02～1562.5 ng/mL、0.012～937.5 ng/mL0.04-1250 ng/mL0.05～819.2 ng/mL以及0.10～218.7 ng/mL,检测五种农药标准曲线的决定系数(R2)均大于0.99,标准曲线拟合良好。选择毒死蜱、三唑磷、对硫磷、甲基对硫磷、杀扑磷、溴硫磷、灭多威、虫螨威、残杀威、仲丁威以及异丙威进行交叉反应实验,不同农药的交叉反应率均很低(5%),该检测方法对农药干扰物无明显交叉反应,特异性良好。本方法在苹果、莴笋、白菜、黄瓜以及西红柿中的添加回收率范围分别为88.9-106.2%、82.6-106.3%、85.4-105.5%、88.7-104.3%和85.6～103.5%,在环境水样中的添加回收率范围为83.3%～102.2%,LC-MS/MS方法在苹果、莴笋、白菜、黄瓜以及西红柿中添加回收率分别为85.9%～104.3%、88.4%～105.6%、86.7%-103.6%,84.6%～102.7和85.3%-105.6%,在环境水样中的添加回收率范围为85.6%-95.3%,这两种方法的添加回收实验结果基本吻合。通过方法比对实验,进一步确定了液相芯片检测方法的准确性,与传统的LC-MS/MS方法相比,基于光子晶体水凝胶微球的液相芯片检测方法简便、快速、结果稳定可靠,能够满足农产品以及环境水样中痕量农药的检测要求,可以作为一种简便、快捷、高通量的检测方法用于农产品和环境水样中有机磷农药和氨基甲酸酯类农药残留的定量检测。
【关键词】：光子晶体 水凝胶 液相芯片 有机磷农药 氨基甲酸酯类农药
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S481.8
【目录】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-16
• 缩略词中英文对照16-19
• 前言19-25
• 第一章 胶体光子晶体微球的制备25-34
• 1.1. 材料与方法25-29
• 1.1.1 主要实验仪器25-26
• 1.1.2 主要实验试剂26-27
• 1.1.3 协流式微流控平台的搭建27-28
• 1.1.4 胶体光子晶体微球的制备28-29
• 1.2 结果29-31
• 1.2.1 胶体光子晶体微球的组装29-31
• 1.2.2 胶体光子晶体微球的光学特性31
• 1.3 讨论31-33
• 1.4 小结33-34
• 第二章 基于胶体光子晶体微球的农药多残留检测技术34-50
• 2.1 材料与方法35-38
• 2.1.1 主要实验仪器35
• 2.1.2 主要实验试剂35-36
• 2.1.3 方法36-38
• 2.1.3.1 农药抗体在胶体光子晶体微球表面的固定36-37
• 2.1.3.2 检测条件的优化37
• 2.1.3.3 构建同时检测农药甲基毒死蜱和杀螟硫磷的标准曲线37-38
• 2.1.3.4 方法学评价38
• 2.2 结果38-44
• 2.2.1 反应体系的优化38-40
• 2.2.2 同时检测农药甲基毒死蜱和杀螟硫磷标准曲线的绘制40-42
• 2.2.3 方法学评价42-44
• 2.3 讨论44-49
• 2.4 小结49-50
• 第三章 基于光子晶体水凝胶复合微球的农药多残留检测技术50-79
• 3.1 材料与方法51-57
• 3.1.1 主要实验仪器51
• 3.1.2 主要实验试剂51-52
• 3.1.3 方法52-57
• 3.1.3.1 光子晶体水凝胶复合微球的制备52
• 3.1.3.2 农药抗原在微球表面的固定52-53
• 3.1.3.3 反应体系的优化53-54
• 3.1.3.4 构建同时检测五种农药的标准曲线54-55
• 3.1.3.5 方法学评价55
• 3.1.3.6 环境水样的采集及样品前处理55
• 3.1.3.7 农药多残留检测试剂盒的初步设计55-57
• 3.2 结果57-73
• 3.2.1 水凝胶组分的优化57-59
• 3.2.2 检测条件的优化59-64
• 3.2.3 同时检测五种农药标准曲线的绘制64-66
• 3.2.4 方法学评价66-71
• 3.2.5 环境水样的检测分析71-73
• 3.3 讨论73-78
• 3.4 小结78-79
• 总结79-80
• 展望80-81
• 参考文献81-93
• 综述93-123
• 参考文献110-123
• 作者简介123-125
• 致谢125-126

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