OsDCL1基因沉默增强水稻对稻瘟菌的基础抗性机理

发布时间：2017-03-22 17:17

  本文关键词：OsDCL1基因沉默增强水稻对稻瘟菌的基础抗性机理，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：水稻是世界上最重要的粮食作物之一。全球近一半的人口,以大米为主食。由稻瘟菌引起的稻瘟病,严重危害水稻生长,每年给水稻生产带来巨大经济损失。为适应环境的变化,抵抗外界不利因素的影响,植物在长期的进化中产生了两个层次的免疫系统：PTI反应和ETI反应,以抵御病原菌的侵袭。 小分子RNA s是一类20-24nt、广泛存在于真核生物中的非编码RNA。植物niRNAs基因位于基因间隔区或内含子区域,按其合成途径可分为miRNAs (microRNAs)口siRNAs (short interfering RNAs),由不同的RNaseⅢ-like Dicer酶合成,在基因沉默过程中发挥着重要作用。DCL1(dicer like1)基因已被证明参与miRNAs的生物合成,在植物的生长发育过程中发挥着决定性作用,而且研究报道,拟南芥的DCLl基因在植物对抗病原菌的免疫反应中起作用。本文探讨了水稻OsDCL1基因在植物免疫反应中的作用,发现OsDCL1基因的沉默增强了水稻对稻瘟菌的基础抗性,主要结果如下： 1. OsDCL1-RNAi突变体表型及抗瘟性分析。对不同OsDCLs基因在受到稻瘟菌侵染后的表达动态进行分析,发现OsDCL1基因的表达在接种稻瘟菌后呈下调趋势,而miRl62a,作为靶标降解OsDCL1的miRNA,在受到稻瘟菌侵染后其表达却呈现上升的趋势,因此在miR162a和OsDCL1基因之间可能存在一种负向反馈调节机制。为了进一步验证OsDCL1是否参与水稻的免疫反应,创制了OsDCL1沉默突变体；OsDCL1-RNAi突变体表现出植株矮小、叶片变窄、分蘖减少和叶绿体异位表达等,并且增强了对3个稻瘟菌有毒生理小种的广谱抗性。对菌丝侵染的邻近细胞进行过氧化氢积累和细胞死亡实验也证实了OsDCL1基因的沉默激活了细胞免疫反应。同时(OsDCL1基因的沉默激活了些抗病相关基因的组成表达,11个PR基因和2个PTI相关基因OsKS4和OsNAC4均在OsDCL1-RNAi突变体中被诱导表达。对这13个基因进行稻瘟菌接种后的表达模式分析,结果呈现出2种变化趋势：(1)受到稻瘟菌侵染后表达上调,在36hpi或48hpi达到峰值,而后随着时间的推移,表达呈下调趋势；(2)受到稻瘟菌侵染后,随着时间的推移呈上升趋势,直到72hpi； 2OsDCL1基因沉默引起水稻转录组变化和差异基因分析。通过转录组测序的方法,对野生型水稻Nipponbare(NPB)和OsDCL1-RNAi突变体在稻瘟菌侵染前后的基因表达进行了分析和比较。响应稻瘟菌侵染的7129个差异表达基因中,参与生物胁迫反应、信号通路、蛋白代谢和RNA调控4个通路的基因明显被富集。以未受稻瘟菌侵染的野生型中基因表达为对照,在OsDCL1-RNAi突变体中共发现1318个DEGs,且超过70%的DEGs是上调的,其中大多数基因参与了生物胁迫反应和信号通路,并且,上调表达基因中与生物胁迫反应相关的主要为PR基因和细胞壁相关基因；分析还发现10个JA((jasmonic acid))相关基因和11个SA (salicylic acid)目关基因分别在OsDCL1-RNAi突变体中被抑制和诱导表达。采用qRT-PCR的方法,验证差异表达基因,其结果与DEGs基本一致。同时,筛选5个差异表达的WRKY基因,构建过表达载体,获得转基因植株,表型分析及机理研究还在进一步实验中。对OsDCL1-RNAi突变体中转录组变化的分析为更深入了解由于OsDCLl基因沉默而增强水稻的抗瘟性机制提供了更多的信息； 3. OsDCLl沉默突变体接种稻瘟菌前后差异表达miRNA分析。用高通量测序的方法,鉴定了一批与免疫反应相关的miRNAs,并用茎环RT-PCR的方法分析其中的12个niRNAs受到稻瘟菌侵染后Oh、12h、24h、36h、48h、72h的表达模式,其中5个呈下调趋势,7个呈上调趋势。最终筛选3个差异表达的miRNAs,采用在植物体内过量表达靶基因模拟物的方法,然后通过稳定的遗传转化方法获得过量表达niRNAs海绵的转基因植株。重点对miRNA159a.1/b的功能缺失突变体进行了表型分析和鉴定,niiRNA159a.1/b功能缺失突变体植株矮小、种子变小、开花偏晚、对稻瘟菌的抗性提高。 综上所述,水稻可以通过调控依赖于OsDCL1基因引起的转录组重排和miRNA生物合成途径激活对抗稻瘟菌的基础免疫反应。
【关键词】：水稻 稻瘟菌 OsDCL1 抗病机理 转录组 miRNAs
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.111.41
【目录】：

• 致谢6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-16
• 表目录16-17
• 图目录17-18
• 缩略词表18-20
• 第一章 文献综述20-34
• 1.1 稻瘟菌侵染机制20
• 1.2 植物免疫反应机制20-24
• 1.3 参与植物免疫反应的miRNA24-32
• 1.3.1 植物内源小分子RNA24-25
• 1.3.2 植物miRNA靶基因预测25-26
• 1.3.3 miRNAs在PTI免疫反应中的作用26
• 1.3.4 miRNAs在ETI免疫反应中的作用26-28
• 1.3.5 miRNAs在水稻免疫反应中的作用28-29
• 1.3.6 参与植物免疫反应的与小RNA路径相关的基因29-31
• 1.3.7 miRNAs在植物与病原菌拮抗过程中的作用31-32
• 1.4 转录组分析在研究植物免疫反应中的应用32-33
• 1.5 目的与意义33-34
• 第二章 OsDCL1-RNAi突变体表型及抗瘟性分析34-61
• 2.1 材料与方法35-47
• 2.1.1 供试植物35
• 2.1.2 菌株及克隆载体35
• 2.1.3 稻瘟菌分生孢子的准备、喷雾接种及抗性鉴定35
• 2.1.4 RNA提取35-36
• 2.1.5 cDNA第一链合成(TIANGENFastQuantcDNA第一链合成试剂盒）36
• 2.1.6 半定量PCR36-37
• 2.1.7 qRT-PCR37-38
• 2.1.8 stem-loop RT-PCR38-39
• 2.1.9 RNAi载体构建39-44
• 2.1.9.1 总 RNA 提取(Tirzol 法）39
• 2.1.9.2 引物设计39-40
• 2.1.9.3 胶回收(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit)40
• 2.1.9.4 克隆反应体系的建立40
• 2.1.9.5 大肠杆菌转化40-41
• 2.1.9.6 抽提质粒(AxyPrep Plasmid Miniprep Kit)41
• 2.1.9.7 阳性重组子的鉴定41-42
• 2.1.9.8 酶切、胶回收42
• 2.1.9.9 pENTA-DCL1载体的构建42-43
• 2.1.9.10 LR反应43
• 2.1.9.11 农杆菌转化43-44
• 2.1.10 转基因植株的获得44-45
• 2.1.10.1 诱导愈伤组织44
• 2.1.10.2 继代44
• 2.1.10.3 共培养44
• 2.1.10.4 洗愈伤44
• 2.1.10.5 分化44
• 2.1.10.6 生根44-45
• 2.1.11 病斑统计45
• 2.1.12 点接种45
• 2.1.13 植物基因组DNA提取(CTAB法）45-46
• 2.1.14 水稻叶鞘侵入分析46
• 2.1.15 水稻叶岕 DAB(diaminobenzidine)染色46
• 2.1.16 水稻叶鞘台盼蓝染色46-47
• 2.2 结果与分析47-58
• 2.2.1 OsDCLs基因的检测与表达47-49
• 2.2.2 半定量RT-PCR49-50
• 2.2.3 Os-miRl62a受稻瘟菌侵染后的表达模式分析50
• 2.2.4 OsDCL1-RNAi转基因植株的鉴定50-52
• 2.2.5 OsDCL1-RNAi突变体中不同OsDCLs基因的表达52-53
• 2.2.6 OsDCL1-RNAi突变体的表型分析53-54
• 2.2.7 OsDCL1-RNAi突变体的抗瘟性鉴定54-55
• 2.2.8 菌丝侵染实验55-56
• 2.2.9 细胞死亡实验56-57
• 2.2.10 OsDCL1基因的沉默激活一些抗病基因的组成型表达57-58
• 2.3 讨论58-61
• 第三章 OsDCL1-RNAi转录组和差异基因的分析61-75
• 3.1 材料与方法62
• 3.1.1 供试材料62
• 3.1.2 载体及菌株62
• 3.1.3 转录组测序和分析62
• 3.1.4 qRT-PCR验证62
• 3.2 结果与分析62-72
• 3.2.1 OsDCL1-RNAi突变体在接种稻瘟菌前后转录组水平的变化62-63
• 3.2.2 DEGs功能富集分析和抗病相关基因表达分析63-67
• 3.2.3 JA和SA信号通路相关基因67-68
• 3.2.4 qRT-PCR验证和分析参与稻瘟菌免疫反应基因68-71
• 3.2.5 5个差异表达基因过表达载体的构建71-72
• 3.3 讨论72-75
• 第四章 DCL1沉默突变体接种稻瘟菌前后小分子RNA和基因表达谱差异分析75-85
• 4.1 材料与方法76-78
• 4.1.1 供试植物76
• 4.1.2 载体及菌株76
• 4.1.3 miRNA测序及分析76
• 4.1.4 茎环式RT-PCR76-77
• 4.1.5 miRNA海绵设计及序列合成77-78
• 4.2 结果与分析78-83
• 4.2.1 受稻瘟菌诱导表达的miRNA78-80
• 4.2.2 miRNA159a.l/b的表型分析及抗病性鉴定80-83
• 4.3 讨论83-85
• 参考文献85-103
• 附表103-107
• 附录Ⅰ107-114
• 附录II114-115
• 作者简历115

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：261953