西瓜果实类胡萝卜素代谢相关基因的克

发布时间：2020-07-10 11:39

【摘要】：类胡萝卜素为以多个共轭的碳碳双键为生色系骨架的脂肪族或脂环族类型化合物,是由植物和微生物合成的一大类色素,因具有多种医学生物学功能而广受关注。西瓜(Citrullus lanatus)属于大众化水果之一,瓜瓤所具有的红、粉红、黄、白等瓤色是由类胡萝卜素组成与含量的差异所致的,研究西瓜类胡萝卜素生物合成积累代谢,并进行遗传操作,探讨其抗肿瘤作用,可为西瓜类胡萝卜素的开发利用,进行西瓜营养育种和种质创新提供依据。本课题从基因水平上分析西瓜果实类胡萝卜素合成代谢的调控机制,并建立农杆菌介导的西瓜遗传转化体系,试图通过转基因技术对西瓜果实类胡萝卜素的成分进行改良。此外,本课题还对番茄红素和β-胡萝卜素抗肿瘤作用的分子机制进行研究。主要内容如下:利用RT-PCR和RACE技术从西瓜果实中分离获得r{牛儿基r{牛儿基焦磷酸合成酶基因GGPS和八氢番茄红素合成酶基因PSY的c DNA全长序列,并通过生物信息学方法对其核酸及推导的氨基酸序列进行分析。结果显示,(1)西瓜GGPS基因c DNA序列全长1,445 bp(Gen Bank登录号:KF914758),开放阅读框为1,092 bp,编码363个氨基酸,预测蛋白分子量约39 k Da。西瓜GGPS氨基酸序列与同为葫芦科的甜瓜和黄瓜GGPS的同源性高达96%和95%。预测GGPS蛋白N末端存在一段52位氨基酸组成的转运肽信号序列。(2)西瓜PSY基因c DNA序列全长1,561 bp(Gen Bank登录号:KC166870),开放阅读框为1,266 bp,编码421个氨基酸,预测蛋白分子量约47.3 k Da。西瓜PSY氨基酸序列与同为葫芦科的甜瓜和南瓜PSY的同源性分别高达95%和94%。预测PSY蛋白N末端存在一段43位氨基酸组成的转运肽信号序列,转运肽剪切后的PSY蛋白第209-231位氨基酸为一跨膜螺旋结构。种植四种不同瓤色的西瓜:红瓤“CN66”、粉瓤“CN62”、黄瓤“ZXG381”和白瓤“ZXG507”,采摘收集各发育和成熟时期(授粉后6天、12天、18天、24天、30天、36天)的果实样品,利用HPLC法检测类胡萝卜素的组成和含量,通过RT-q PCR技术分析类胡萝卜素代谢相关酶基因(GGPS,PSY,PSY-A,PDS,ZDS,CRTISO,LCYB,CHYB,ZEP,NCED1,NCED2和NCED3)的表达。结果显示,红瓤“CN66”和粉瓤“CN62”成熟果实中主要含番茄红素,以及少量的八氢番茄红素、六氢番茄红素、δ-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素和紫黄质。其中,番茄红素在12 DAP时出现,在此后的发育时期,其含量逐渐增加并成为主要的类胡萝卜素。在18-30 DAP期间,“CN66”中大多数类胡萝卜素合成酶基因(包括GGPS)的表达量大幅增高,而代谢酶基因NCED1和NCED2的表达量较低,导致该时期类胡萝卜素的大量积累;黄瓤“ZXG381”中主要含叶黄素和紫黄质,并且在果实发育和成熟过程中,其二者含量分别与CHYB和ZEP基因的表达量呈正相关;在白瓤“ZXG507”果实发育过程中,始终只能检测到痕量的叶黄素和紫黄质,主要归因于类胡萝卜素合成酶基因(尤其GGPS)的表达量较低,而代谢酶基因NCED1则保持较高的表达量。该结果表明,类胡萝卜素合成代谢相关酶基因的转录调控,对不同瓤色西瓜果实中类胡萝卜素的组成和含量具有十分重要的影响。分别构建由西瓜果实特异性AGPL1启动子驱动类胡萝卜素合成相关酶基因(GGPS,PSY,LCYB)的植物表达载体,并转入根癌农杆菌EHA105中。建立西瓜品种“红一号”的子叶体外再生体系和农杆菌介导的遗传转化体系,试图将GGPS基因转化西瓜。结果显示,(1)以3 d龄的无菌苗子叶为外植体,接种至不定芽诱导培养基MS+6-BA 1 mg/L+IAA 0.2 mg/L中,获得的诱导率最高;最适生根培养基为1/2MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L。(2)不定芽诱导阶段的卡那霉素筛选浓度为75 mg/L,生根阶段的筛选浓度为40 mg/L。氨苄青霉素浓度为200 mg/L或头孢霉素浓度为300 mg/L时,对外植体的生长无明显影响,可用于农杆菌侵染后的脱菌和抑菌过程。外植体经预培养2 d,用OD600值0.5的农杆菌EHA105(转入植物表达载体p AGPL1-GGPS)菌液浸染10 min,再共培养3 d,有利于提高遗传转化的效率。经PCR检测,初步证实GGPS基因已经导入西瓜植株,转化频率为1.33‰。利用MTT法检测番茄红素和β-胡萝卜素对人食管鳞癌细胞EC109增殖的影响,通过Western Blotting技术分析上述类胡萝卜素对PPAR?、p21WAF1/CIP1、Cyclin D1以及Cox-2蛋白表达的影响。结果显示,番茄红素和β-胡萝卜素(5-40μM)均能显著抑制EC109细胞增殖,其抑制程度与处理浓度和时间呈正相关,即呈剂量-时间依赖效应;使用3μM GW9662(PPAR?特异性抑制剂)预处理,能够部分减弱上述类胡萝卜素对细胞的抑制作用;番茄红素和β-胡萝卜素(40μM)均能显著促进PPAR?和p21WAF1/CIP1表达,抑制Cyclin D1和Cox-2表达,而经GW9662预处理,能够显著削弱上述类胡萝卜素引起的PPAR?、p21WAF1/CIP1、Cyclin D1以及Cox-2的表达变化。该结果表明,番茄红素和β-胡萝卜素能通过PPARγ信号通路调控p21WAF1/CIP1和Cyclin D1的表达,干涉癌细胞周期进程,同时下调Cox-2表达,进而发挥对癌细胞增殖的抑制作用。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S651;Q943.2

【参考文献】