油菜和拟南芥中几个硫代葡萄糖苷合成及调控基因的功能分析

发布时间：2017-04-09 20:07

  本文关键词：油菜和拟南芥中几个硫代葡萄糖苷合成及调控基因的功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：为了适应复杂的生存环境,植物在长期的进化过程中产生了种类繁多且功能各异的代谢产物,以应对时刻变化的外界因素以及各种胁迫。硫代葡萄糖苷(简称硫苷)是白花菜目植物所特有的一类含硫、氮的重要次生代谢产物。近年来硫苷的代谢途径被称作研究次生代谢产物的 模式系统‖,硫苷在植株防御、硫元素的调节以及人类预防多种疾病等方面都发挥着重要的作用。多种多样的胁迫促使植物体内产生了多种功能各异的硫苷,而且硫苷还很容易受到其它防御化合物的诱导,这些都导致硫苷的代谢调控网络及其硫苷调控机制的研究十分复杂。与拟南芥拥有共同祖先的重要的油料作物油菜由于其异源四倍体基因组的复杂性,硫苷代谢的研究目前还不够深入,一定程度上影响了硫苷的防御功能在油菜中的应用。为了深入了解硫苷调控及其生物学功能,我们开展了以下三个方面的研究:1)利用共表达分析拟南芥中新进化来的苯甲酰氧基硫苷代谢途径的相关基因,鉴定并验证了两个保守的转录因子MYB115和MYB118可以调控硫苷代谢的相关基因的表达;2)分析了甘蓝型油菜中三个硫苷合成途径上的基因Bn MAM1、Bn CYP83A1和Bn UGT74B1在硫苷代谢途径中的功能和作用;3)将这三个基因在甘蓝型油菜中过表达后探索转基因植株叶片的抗菌核病和灰霉病的能力。主要研究结果如下:1、通过对拟南芥中新进化的种子特异的苯甲酰氧基硫苷代谢的相关基因(AOP3、BZO1和SCPL17)共表达分析,鉴定到两个可能调控硫苷代谢的保守的转录因子MYB115和MYB118。与硫苷合成代谢相关基因的酵母单杂交验证和基因表达分析表明,这两个转录因子参与拟南芥硫苷的代谢调控。对MYB115和MYB118单基因缺失突变体的种子、叶片和花器官中硫苷含量分析发现,这两个转录因子的突变导致种子中与AOP3和BZO1相关的亚磺酰基类、羟基类和苯甲酰氧基类硫苷均发生了显著地变化;虽然MYB115和MYB118在叶片中仅有极微量的表达,但这些器官中的脂肪族硫苷均有不同程度的改变;在myb115和myb118突变体的所有的花器官中短链的亚磺酰基类硫苷均有显著地提高,而所有种子、叶片和花器官中的吲哚族硫苷的含量和野生型对照相比均无显著的差异。功能互补实验证明,引入野生型基因到突变体后上述目标性状均能恢复到野生型水平,进一步说明了这两个转录因子参与了多个器官的硫苷代谢调控。2、通过检测MYB115和MYB118双突变体的种子中硫苷含量,结合单、双突变体中相关基因的表达分析,发现这两个转录因子对于调控部分脂肪族硫苷是功能冗余的且存在上位互作效应。此外,MYB115和MYB118以不同的互作模式调控了苯甲酰氧基硫苷代谢相关基因AOP3和BZO1的表达:myb118aop3双突变体中相对于各个单突变体,它的4-亚磺酰丁基硫苷含量显著增加但与其相对应的4-甲硫丁基硫苷并没有提高;在myb115aop3双突变体中4-甲硫丁基硫苷的含量却增加了;双突变体myb118bzo1积累了大量的短链羟基类硫苷,同时它的底物甲硫烷基类硫苷和亚磺酰基类硫苷有着不同程度减少,但myb115bzo1和单突变体bzo1的各种硫苷含量仅有微小的差别。上述结果说明了MYB115和MYB118是两个保守的转录因子且调控了拟南芥中新进化的苯甲酰氧基硫苷代谢,我们因此推断出新进化的代谢途径也可以被保守的调控因子所调控,并不一定需要重新进化新的调控因子,这一结论进一步完善了新进化基因的调控模型。3、我们分别克隆了甘蓝型油菜中脂肪族硫苷合成途径上的两个基因Bn MAM1和Bn CYP83A1,以及参与了脂肪族硫苷和吲哚族硫苷合成途径上的一个基因Bn UGT74B1。通过油菜接种病菌实验发现Bn MAM1和Bn CYP83A1参与了对核盘菌的入侵的早期响应,而Bn UGT74B1在核盘菌侵染的整个时期均有比较高的诱导表达;与菌核病的响应不同的是Bn MAM1和Bn CYP83A1在灰霉菌入侵过程中的表达水平持续降低,而Bn UGT74B1在全过程都有比较高的诱导表达。这些结果说明了甘蓝型油菜在应对这两种死体营养型病菌入侵时脂肪族硫苷和吲哚族硫苷的响应模式可能是不同的。与野生型对照相比,在甘蓝型油菜过表达上述三个基因后,转基因油菜叶片部分脂肪族硫苷含量有所提高(2OH3B GLS和3-Butenyl GLS),过表达Bn UGT74B1还导致叶片吲哚族硫苷(I3M GLS)含量显著提高,这些结果进一步阐述了Bn MAM1,Bn CYP83A1和Bn UGT74B1在甘蓝型油菜的硫苷代谢途径中的相应的功能。4、分别在三个过表达基因的甘蓝型油菜叶片接种核盘菌和灰霉菌,发现过表达Bn UGT74B1的植株叶片接种核盘菌16 h时和接种灰霉菌32 h的发病率均在12%之内,而野生型对照接种这两种病相同时期的发病率都在90%以上,而且过表达Bn UGT74B1的植株叶片接种核盘菌48h时和接种灰霉菌76 h的病斑面积也都显著地小于野生型对照的病斑面积;而过表达Bn MAM1和Bn CYP83A1的植株叶片和野生型对照在发病时期和控制病斑面积上均无显著的差异。上述结果说明了脂肪族硫苷和吲哚族硫苷在甘蓝型油菜植株叶片防御菌核病和灰霉病上发挥的作用并不相同,可以通过改变硫苷的种类或含量进而提高植株对某些病菌的抗性。这些结果可为创建抗病育种材料以及制定育种策略提供参考信息。
【关键词】：硫代葡萄糖苷 共表达 R2R3-MYB 过表达 菌核病 灰霉病
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S332.2
【目录】：

• 摘要8-11
• Abstract11-14
• 缩略词表14-16
• 文献综述16-43
• 1 硫苷的综述17-31
• 1.1 硫苷的结构和分类17-18
• 1.2 硫苷的合成代谢18-26
• 1.2.1 R侧链的延伸19-22
• 1.2.2 核心结构的合成22-23
• 1.2.3 R侧链的修饰23-26
• 1.3 硫苷的转运26
• 1.4 硫苷的降解代谢26-27
• 1.5 硫苷的生物学功能与人类的健康及其危害性27-31
• 1.5.1 植物体内硫元素的平衡27-29
• 1.5.2 参与植物的防御机制29
• 1.5.3 赋予植物不同的风味29
• 1.5.4 硫苷与人类的健康29-30
• 1.5.5 抗营养作用30-31
• 2 硫苷代谢网络调控的研究进展31-39
• 2.1 MYB家族转录因子31-36
• 2.2 MYC家族转录因子36-38
• 2.3 其它转录因子38
• 2.4 植物激素对硫苷的影响38-39
• 3 硫苷防御功能的研究进展39-42
• 3.1 硫苷的抗病性40-41
• 3.2 硫苷的抗虫性41-42
• 4 本研究目的与意义的概述42-43
• 第一章 拟南芥中两个保守的调控因子MYB115和MYB118调控新进化的苯甲酰氧基硫苷代谢途径相关基因的表达43-98
• 引言43-46
• 1 本研究的目的和意义46-47
• 2 材料和方法47-71
• 2.1 实验材料47-51
• 2.1.1 植物材料47
• 2.1.2 载体和菌株47-48
• 2.1.3 酶类48
• 2.1.4 生化试剂与耗材48
• 2.1.5 引物合成与测序分析48
• 2.1.6 软件与数据分析48-49
• 2.1.7 实验仪器49
• 2.1.8 主要试剂的配置49-51
• 2.2 实验方法51-71
• 2.2.1 拟南芥的生长条件51
• 2.2.2 拟南芥插入突变体引物的筛选51-53
• 2.2.3 植物总DNA提取（CTAB法）53-54
• 2.2.4 植物组织总RNA提取的提取及反转录c DNA54-58
• 2.2.5 酵母单杂交分析58-66
• 2.2.6 q RT-PCR表达检测66-68
• 2.2.7 构建遗传互补实验的载体68-70
• 2.2.8 硫苷的检测分析70-71
• 3 结果与分析71-93
• 3.1 共表达分析发现MYB115和MYB118调控BZ-GLS代谢途径71-73
• 3.2 酵母单杂和基因表达检测（q RT-PCR）验证MYB115和MYB118调控硫苷代谢73-79
• 3.3 MYB115和MYB118调控种子中的多种硫苷含量79-81
• 3.4 MYB115和MYB118同时也影响叶片和花器官的硫苷含量81-84
• 3.5 互补实验确认了MYB115和MYB118的单突变体表型84-86
• 3.6 双突变体表明MYB115和MYB118在调控硫苷合成时存在互作86-89
• 3.7 MYB115和MYB118对于硫苷合成的侧链修饰途径中的相关基因表现出不同的互作效应89-93
• 4 讨论93-97
• 4.1 拟南芥中两个保守的转录因子MYB115和MYB118可以调控新进化的基因AOP3和BZO1所合成的BZ-GLS的代谢93-95
• 4.2 MYB115和MYB118调控硫苷合成途径的所有3个阶段95
• 4.3 MYB115和MYB118的遗传互作95-96
• 4.4 MYB115和MYB118不仅影响种子硫苷合成，同时也影响其它组织的硫苷代谢96-97
• 5 本章小结97-98
• 第二章 过表达甘蓝型油菜中三个硫苷合成基因对菌核病和灰霉病的抗性的研究98-131
• 引言98-99
• 1 本研究的目的和意义99
• 2 材料和方法99-114
• 2.1 实验材料99-101
• 2.1.1 植物材料99
• 2.1.2 核盘菌和灰霉菌菌种99-100
• 2.1.3 载体和菌株100
• 2.1.4 酶类100
• 2.1.5 生化试剂与耗材100
• 2.1.6 引物合成与测序分析100
• 2.1.7 软件与数据分析100-101
• 2.1.8 实验仪器101
• 2.1.9 主要试剂的配置101
• 2.2 实验方法101-114
• 2.2.1 甘蓝型油菜的生长条件101-102
• 2.2.2 甘蓝型油菜基因Bn MAM1，Bn CYP83A1和Bn UGT74B1的克隆与表达载体的构建102-104
• 2.2.3 甘蓝型油菜的遗传转化104-105
• 2.2.4 转基因植株的PCR鉴定105-106
• 2.2.5 转基因植株的Southern分析106-110
• 2.2.6 转基因植株的表达分析（RT-PCR和q RT-PCR）110-111
• 2.2.7 油菜叶片接种核盘菌和灰霉菌111
• 2.2.8 油菜叶片硫苷的检测与分析111-114
• 3 结果与分析114-126
• 3.1 克隆甘蓝型油菜Bn MAM1，Bn CYP83A1和Bn UGT74B1基因114-116
• 3.2 Bn MAM1，Bn CYP83A1和Bn UGT74B1分别参与了核盘菌或灰霉菌侵染油菜时的响应116-118
• 3.3 在甘蓝型油菜中过表达Bn MAM1，Bn CYP83A1和Bn UGT74B1118-120
• 3.4 过表达Bn MAM1，，Bn CYP83A1和Bn UGT74B1对油菜叶片硫苷含量的影响120-123
• 3.5 过表达Bn MAM1，Bn CYP83A1和Bn UGT74B1植株对核盘菌和灰霉菌的抗性分析123-126
• 4 讨论126-129
• 4.1 Bn MAM1，Bn CYP83A1和Bn UGT74B1在甘蓝型油菜硫苷合成途径中的功能和作用126-127
• 4.2 脂肪族和吲哚族硫苷的抗病性127-128
• 4.3 转基因对植株不同组织和器官硫苷合成和积累的影响128-129
• 4.4 此研究对抗病育种的启发129
• 5 本章小结129-131
• 参考文献131-147
• 附录147-154
• 附录1 本研究中所涉及到的硫苷的名称、缩写和化学结构式147-150
• 附录2 拟南芥中与AOP3、BZO1和SCPL17共表达的转录因子150-153
• 附录3 作者简介和在读期间发表的论文153-154
• 致谢154-156

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 林丽钦;山葵、辣根、芥末的辛辣成分及功能[J];福建轻纺;1999年09期

2 栾金水,汪莹;浅谈芥末[J];中国调味品;2003年06期

3 李云昌,李英德,梅德圣,黄永菊,徐育松,Roger Wallsgrove,Guy Kiddle,Richard Bennett;中油821接种菌核病菌丝体后的生化反应[J];中国油料作物学报;2001年03期

4 潘刚,周永明;甘蓝型油菜遗传转化的研究进展[J];中国油料作物学报;2003年03期

5 ;Transcriptional Regulation of Plant Secondary Metabolism[J];Journal of Integrative Plant Biology;2012年10期

6 吴健;涂江颖;周永明;;甘蓝型油菜抗菌核病研究进展[J];中国油料作物学报;2013年05期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 李培武;甘蓝型油菜叶片与种子硫苷相关性研究[D];华中农业大学;2007年

  本文关键词：油菜和拟南芥中几个硫代葡萄糖苷合成及调控基因的功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：296007