烟粉虱唾液腺和卵巢在传播双生病毒中的作用

发布时间：2017-04-10 22:41

  本文关键词：烟粉虱唾液腺和卵巢在传播双生病毒中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：双生病毒科(Geminiviridae)是植物病毒中的第二大科,也是唯一一类具有孪生颗粒形态和单链环状DNA基因组的病毒,可在番茄、棉花和木薯等多种经济作物上引起毁灭性的危害。双生病毒主要的传播介体是烟粉虱Bemisia tabaci,通常烟粉虱种群的暴发往往伴随着双生病毒病的流行。探索烟粉虱如何传播双生病毒,有助于揭示双生病毒病流行的过程及机理。本文以两种入侵性极强的Middle East Asia Minor 1 (MEAM1)和Mediterranean (MED)烟粉虱为研究对象,研究了两种双生病毒番茄黄曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)和中国番茄黄曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)经由这两种烟粉虱传播的生理和分子机制。主要研究结果如下：(1) TYLCV在MEAM1烟粉虱中肠、卵巢以及唾液腺的分布通过免疫荧光技术在MEAM1烟粉虱中肠定位TYLCV外壳蛋白(coat protein, CP)发现,TYLCV信号在中肠分布较广,而且在滤室部位富集。在卵巢中定位病毒发现,病毒主要在分布在烟粉虱成熟的卵子中,而未成熟的卵巢管中未见病毒分布；在唾液腺中定位病毒发现,病毒主要分布在唾液腺中间区域的几个细胞,其他区域仅见少量病毒信号。以上结果明确了TYLCV在烟粉虱这三个重要器官中的分布情况。(2) MEAM1和MED烟粉虱特异性传播TYLCV和TYLCCNV的机制通过传毒实验发现,MEAM1可以传播TYLCV和TYLCCNV,而MED仅可以传播TYLCV,不能传播TYLCCNV。比较MEAM1和MED烟粉虱对TYLCCNV的获取和存留能力发现,MED获取和存留TYLCCNV的能力甚至强于MEAM1,说明二者获取和存留病毒能力的差异并不是导致MED不能传播TYLCCNV的原因。通过检测MED体内是否存在TYLCCNV循环的屏障,发现病毒能以较低的效率进入MED的唾液腺但是不能随唾液分泌出来。为了研究病毒CP是否也参与了MED特异性地传播TYLCV和TYLCCNV,将TYLCV与TYLCCNV的CP氨基酸序列中差异较大的部分进行了互换,发现重组CP后的TYLCCNV变得可以被MED传播,而重组CP后的TYLCV则变得几乎不能被MED传播。烟粉虱唾液腺也参与了这两种重组病毒的特异性传播。观察TYLCV和TYLCCNV在MED烟粉虱唾液腺内的动态变化发现,TYLCV在烟粉虱获毒的初始3-12 h内,分布于整个唾液腺,获毒12-24 h之间,病毒逐渐集聚在唾液腺的中间区域。获毒36-72 h后,TYLCV仅分布于唾液腺中间沿唾管分布的细胞,病毒在唾液腺其它部位分布极少。而TYLCCNV在MED烟粉虱获毒的初始4-12 h内,仅有少量病毒信号分布于唾液腺的边缘,获毒24-72h之后,病毒逐渐消失。这两种病毒在MEAM1烟粉虱唾液腺内的运动动态与TYLCV在MED唾液腺中的类似。以上结果表明了烟粉虱的唾液腺和双生病毒的CP共同决定了病毒传播的特异性。(3) MEAM1和MED垂直传播TYLCV的生理和分子机制免疫荧光定位发现TYLCV仅进入MEAM1烟粉虱成熟的卵子,推测TYLCV垂直传播的效率可能与烟粉虱卵巢的发育成熟度有关。进一步验证发现发育成熟的烟粉虱卵巢中的病毒含量显著高于未成熟的卵巢。随着烟粉虱日龄的增加,其垂直传播TYLCV的效率也显著增加,而且经垂直传播获毒的F1代成虫也能侵染健康的植物。烟粉虱卵巢的发育成熟度与卵黄原蛋白(vitellogenin, Vg)密切相关,Vg基因在羽化5天之内的烟粉虱体内的表达量都维持在一个很低的水平,在羽化11d左右会逐渐达到最高水平。免疫定位Vg和TYLCV CP在MEAM1和MED烟粉虱卵巢中的分布发现二者是完全共定位的。分别用TYLCV CP和Vg的单克隆抗体进行免疫共沉淀验证发现,CP抗体可以将携毒烟粉虱总蛋白中的Vg沉淀下来,Vg抗体也可以将携毒烟粉虱总蛋白中的TYLCV CP沉淀下来,说明二者在烟粉虱体内互作。通过饲喂烟粉虱Vg的抗体方法阻碍病毒与Vg结合,发现饲喂抗体后,病毒垂直传播的效率降低。以上结果表明TYLCV垂直传播的效率与烟粉虱的卵巢发育进程有关,烟粉虱的卵黄原蛋白Vg可以帮助TYLCV垂直传播至下一代。综上所述,本研究阐明了两种病毒在烟粉虱体内的分布情况,揭示了两种病毒经由烟粉虱MEAM1和MED隐种特异性传播以及经卵垂直传播的重要生理和分子机制。这些研究结果加深了对烟粉虱传播双生病毒机制的认识,为进一步揭示烟粉虱传双生病毒的分子机制、研发阻碍烟粉虱传毒的新方法提供了理论基础。
【关键词】：烟粉虱 番茄黄曲叶病毒 中国番茄黄曲叶病毒 烟粉虱-双生病毒互作 外壳蛋白 垂直传播 唾液腺 卵巢
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.41;S433
【目录】：

• 致谢7-11
• 摘要11-13
• Abstract13-21
• 第一章 文献综述与研究目的21-40
• 1.1 烟粉虱21-22
• 1.1.1 烟粉虱概述21-22
• 1.1.2 烟粉虱的危害现状22
• 1.2 双生病毒概述及其危害22-27
• 1.2.1 双生病毒科的分类、寄主范围及介体传播22-24
• 1.2.2 双生病毒(菜豆金黄花叶病毒属)的基因组结构和功能24-26
• 1.2.3 双生病毒危害26-27
• 1.3 双生病毒与介体昆虫的互作27-35
• 1.3.1 介体昆虫传播植物病毒的方式27-28
• 1.3.2 双生病毒由烟粉虱经卵和交配传播28-29
• 1.3.3 烟粉虱传播双生病毒的特异性及其机制29-31
• 1.3.3.1 烟粉虱传播双生病毒的特异性29
• 1.3.3.2 影响烟粉虱特异性传播双生病毒的器官29-30
• 1.3.3.3 参与病毒循环传播的烟粉虱蛋白30
• 1.3.3.4 双生病毒的外壳蛋白30-31
• 1.3.4 内共生细菌对烟粉虱传毒的影响31-32
• 1.3.5 双生病毒对烟粉虱的直接影响32-35
• 1.3.5.1 双生病毒对烟粉虱存活和产卵的影响32-33
• 1.3.5.2 双生病毒对烟粉虱取食行为的影响33-34
• 1.3.5.3 双生病毒侵染对烟粉虱基因表达的影响34-35
• 1.4 植物介导的双生病毒与烟粉虱互作35-38
• 1.4.1 植物介导的双生病毒-烟粉虱互作的多样性35-36
• 1.4.2 植物介导的双生病毒-烟粉虱互作的生理和分子机制36-38
• 1.5 本研究目的与主要内容38-40
• 1.5.1 本研究目的38-39
• 1.5.2 研究内容39-40
• 第二章 基本材料和方法40-59
• 2.1 基本材料40-44
• 2.1.1 供试昆虫40
• 2.1.2 供试植物40-41
• 2.1.3 供试病毒41
• 2.1.4 感毒植物的获取41
• 2.1.5 生态学相关仪器设备41-42
• 2.1.6 分子生物学主要仪器设备42-43
• 2.1.7 分子生物学常用试剂43-44
• 2.2 基本实验方法44-59
• 2.2.1 烟粉虱隐种鉴定方法(RFLP-PCR)44-48
• 2.2.1.1 烟粉虱总DNA的提取44
• 2.2.1.2 PCR反应体系(20μL/份)44
• 2.2.1.3 PCR反应条件44-45
• 2.2.1.4 TaqI酶切PCR产物45
• 2.2.1.5 PCR产物的纯化、克隆及单菌落测序45-48
• 2.2.1.5.1 PCR产物的纯化45-46
• 2.2.1.5.2 PCR纯化产物连接46
• 2.2.1.5.3 大肠杆菌感受态细胞制备46
• 2.2.1.5.4 大肠杆菌感受态细胞转化46-47
• 2.2.1.5.5 测序47
• 2.2.1.5.6 碱裂解法小量提取大肠杆菌质粒47-48
• 2.2.2 重叠延伸PCR技术48-49
• 2.2.3 重组质粒导入根癌农杆菌及植物接种49-50
• 2.2.3.1 根癌农杆菌感受态细胞制备49
• 2.2.3.2 重组质粒电击转化根癌农杆菌49-50
• 2.2.3.3 农杆菌介导的植物接种50
• 2.2.4 感毒植物和携毒烟粉虱的鉴定50-51
• 2.2.4.1 植物基因组和携毒烟粉虱总DNA的提取50
• 2.2.4.2 PCR检测植物和烟粉虱体内的病毒DNA50-51
• 2.2.5 实时荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)技术51-54
• 2.2.5.1 烟粉虱总RNA提取51-53
• 2.2.5.2 烟粉虱cDNA合成53
• 2.2.5.3 qPCR体系53-54
• 2.2.5.4 (RT)qPCR数据分析54
• 2.2.6 Western杂交(Western Blot,WB)54-56
• 2.2.6.1 烟粉虱总蛋白的提取54-55
• 2.2.6.2 蛋白浓度测定55
• 2.2.6.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)55
• 2.2.6.4 电转移55-56
• 2.2.6.5 Western印迹分析56
• 2.2.7 Light microscopy(LM)56-57
• 2.2.8 荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)57
• 2.2.9 免疫荧光技术(Immunofluorescence,IF)57-59
• 第三章 双生病毒在烟粉虱体内的分布59-67
• 3.1 基本材料60-61
• 3.1.1 供试昆虫、植物和病毒60
• 3.1.2 主要试剂和抗体60-61
• 3.2 实验方法61
• 3.2.1 MEAM1获取TYLCV61
• 3.2.2 烟粉虱器官的解剖与收集61
• 3.2.3 免疫荧光定位61
• 3.3 结果与分析61-65
• 3.3.1 烟粉虱唾液腺、中肠及卵巢形态特征61-63
• 3.3.2 TYLCV在烟粉虱中肠的分布63
• 3.3.3 TYLCV在烟粉虱卵巢的分布63-64
• 3.3.4 TYLCV在烟粉虱唾液腺的分布64-65
• 3.4 讨论65-67
• 第四章 烟粉虱特异性传播TYLCV及TYLCCNV的生理和分子机制67-92
• 4.1 基本材料68
• 4.1.1 供试昆虫、植物和病毒68
• 4.1.2 主要试剂68
• 4.2 实验方法68-74
• 4.2.1 双生病毒经MEAM1或MED烟粉虱传播能力的检测68-69
• 4.2.2 烟粉虱获取和存留TYLCCNV能力的检测69
• 4.2.3 PCR检测双生病毒在烟粉虱各个组织及唾液中的分布69
• 4.2.4 FISH检测双生病毒在烟粉虱中肠及唾液腺的分布69-70
• 4.2.5 TYLCV和TYLCCNV CP互换的重组病毒的载体构建70-74
• 4.2.6 双生病毒在烟粉虱唾液腺内的动态变化74
• 4.3 结果与分析74-89
• 4.3.1 烟粉虱不同隐种传播TYLCV及TYLCCNV的能力74
• 4.3.2 烟粉虱获取和存留TYLCCNV能力的比较74-76
• 4.3.3 TYLCCNV在烟粉虱各个组织及唾液的分布76-79
• 4.3.4 烟粉虱不同隐种传播重组病毒的能力79-80
• 4.3.5 重组病毒在烟粉虱体内的存留80-83
• 4.3.6 双生病毒在烟粉虱唾液腺的动态变化83-89
• 4.4 讨论89-92
• 第五章 烟粉虱垂直传播TYLCV的生理及分子机制的初步探索92-113
• 5.1 基本材料92-93
• 5.1.1 供试昆虫、植物和病毒92-93
• 5.1.2 主要试剂93
• 5.2 实验方法93-98
• 5.2.1 IF检测TYLCV在烟粉虱卵巢的分布93
• 5.2.2 qPCR检测TYLCV在烟粉虱不同发育阶段的虫体及卵巢中的相对量93
• 5.2.3 检测不同发育阶烟粉虱经卵传播TYLCV的能力93-94
• 5.2.4 携带TYLCV的烟粉虱子代成虫侵染植物能力检测94-95
• 5.2.5 qPCR检测Vg在烟粉虱不同发育阶段的相对表达量95
• 5.2.6 IF共定位TYLCV和Vg在烟粉虱卵巢的分布95
• 5.2.7 TYLCV CP和Vg的体外互作95-97
• 5.2.8 饲喂烟粉虱Vg抗体对其F1代卵的带毒率的影响97-98
• 5.3 结果与分析98-110
• 5.3.1 免疫荧光定位TYLCV在MEAM1烟粉虱卵巢的分布98-99
• 5.3.2 TYLCV在烟粉虱不同发育阶段的虫体及卵巢中的相对含量99-100
• 5.3.3 TYLCV经由不同发育阶段烟粉虱垂直传播的特性100-101
• 5.3.4 携带TYLCV的烟粉虱子代成虫侵染植物能力检测101-102
• 5.3.5 qPCR检测Vg在烟粉虱不同发育阶段的相对表达量102-103
• 5.3.6 免疫荧光共定位TYLCV和Vg在烟粉虱卵巢的分布103-106
• 5.3.7 免疫共沉淀检测TYLCV CP和Vg的体内互作106-108
• 5.3.8 饲喂烟粉虱Vg抗体后对其垂直传播病毒能力的影响108-110
• 5.4 讨论110-113
• 第六章 总讨论113-120
• 6.1 本研究的特色和创新之处116
• 6.2 本研究存在的问题116-117
• 6.3 值得继续研究的问题117-120
• 参考文献120-130

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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