功能性氨基酸对猪上皮细胞蛋白周转及母猪繁殖性能的作用机制研究

发布时间：2017-04-11 03:19

  本文关键词：功能性氨基酸对猪上皮细胞蛋白周转及母猪繁殖性能的作用机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：作为三大主要营养物质之一的蛋白质在机体代谢和生长发育中有着重要的作用,是影响畜禽生长发育和胴体构成的主要营养因素。饲料蛋白在进入畜禽消化道后,在小肠部位被多种消化酶酶解为各种氨基酸和多肽,而后被消化系统转运吸收,其中多肽在细胞中最终被分解成氨基酸,并进一步被利用。蛋白质营养其实质是氨基酸营养。传统营养学将氨基酸划分为必需氨基酸和非必需氨基酸两大类。一直以来,必需氨基酸一直是动物营养研究的焦点,而非必需氨基酸的营养作用研究未得到营养学家们的重视。近期的研究发现,在目前猪饲喂方式和营养需求标准下,“非必需氨基酸”并不能满足自身生长、泌乳、健康的需要。目前,有关功能性氨基酸对肠道健康以及肠道蛋白质合成的作用已有报道,而对其详细的代谢通路的作用机制却不清楚；功能性氨基酸对泌乳猪乳腺细胞蛋白质的代谢以及相关信号通路调节也鲜有报道。因此本研究结合以往的研究,以猪肠上皮细胞(IPEC-1)和猪乳腺上皮细胞(PMEC)为研究对象,重点研究部分功能性氨基酸,分别为精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、脯氨酸(Pro),对细胞增殖／蛋白合成、蛋白质降解以及相关信号通路的影响,结果将为功能性氨基酸在养猪业的应用提供必要的理论基础和数据支持。1泌乳性能差异母猪血清代谢组分析本试验旨在通过代谢组学手段对比分析泌乳性能优异和较差的母猪血清差异,来寻找和确定能够反映泌乳性能差异的标志性代谢物。试验选取遗传背景相同,胎次相近,泌乳性能不同的哺乳母猪并收集血浆样本16例,分为A组(泌乳性能较好)和B组(泌乳性能较差),每组8例样本,对采集的样本进行LC-MS检测分析,针对检测结果,组间对比并进行差异代谢物筛选及鉴定。我们筛选鉴定出了以氨基酸,非饱和脂肪酸,有机酸,神经递质为主的差异代谢物,其中氨基酸主要包括：精氨酸,高精氨酸(A组高于B组,P0.05)；脯氨酸,亮氨酸(A组低于B组,P0.05)；非饱和脂肪酸包括：油酸,亚油酸(A组高于B组,P0.05)；有机酸包括：苹果酸,琥珀酸(A组高于B组,P0.05)；神经递质：多巴胺(A组低于B组,P0.05)。差异代谢物均以PLS-DA模型的VIP (Variable Importance in the Projection)值作为鉴定依据(阈值均1),其中以精氨酸最为突出,泌乳性能较好的母猪血浆中的精氨酸含量是泌乳性能差的母猪血浆中精氨酸含量1.397倍,P=0.003,说明精氨酸在母猪泌乳过程中的重要性。2 Arg, Glu, Gln, Pro对肠上皮细胞蛋白质代谢及信号通路的影响以猪IPEC-1为研究对象,首先将1×104活细胞接种于含有0.5mLDMEM完全培养基的24孔细胞培养板中,于37℃培养过夜,然后更换本试验选用的4种功能性氨基酸浓度分别为OmM,0.06 mM,0.12 mM,0.24 mM的特殊培养基,在第0、2、4、6天分别获取不同浓度及不同种类功能性氨基酸处理的培养细胞,进行细胞计数操作,测定4种功能性氨基酸对猪肠道上皮细胞增殖的影响。结果表明,Arg, Glu, Gln, Pro四种氨基酸都可以促进细胞的增殖,且Arg的效果最好。根据细胞增殖的结果,选取并考察了不同浓度精氨酸对肠道上皮细胞中蛋白质合成以及相关信号通路中的关键信号蛋白的表达量及磷酸化的影响,同时为了考察NO合成酶在其中的作用,本实验设计了10μM、100μM、350μM、100μM+L-NAME(NO合成酶抑制剂)和350μM+L-NAME5个处理组进行细胞培养,实验结果表明,当培养基中精氨酸浓度分别为10μM、100μM和350μM时,100μM和350gM处理组中mTOR、4EBP1和p70S6磷酸化水平显著高于10μM精氨酸处理组(P0.05)；相同精氨酸浓度下,添加NO合成酶抑制剂对的mTOR、4EBP1和p70S6K蛋白的磷酸化起抑制作用(P0.05),但其磷酸化蛋白表达水平仍显著高于10gM精氨酸处理组(P0.05)；各处理组mTOR和4EBP1蛋白表达水平差异均不显著(P0.05)。100μM和350 gM精氨酸处理组p-P13K、Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白表达水平均显著高于10μM精氨酸处理组(P0.05)；与100gM精氨酸处理组相比,100μM Arg+L-NAME处理组的p-PI3K、Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白表达水平均显著降低(P0.05)；与350μM精氨酸处理组相比,350μM Arg+L-NAME处理组p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达水平也显著降低(P0.05)。3 Arg对乳腺细胞蛋白质合成及信号通路的影响通过体外培养猪乳腺上皮细胞,检测了Arg对母猪乳腺上皮细胞增殖的调节作用及其机制,在木试验可知,培养液中添加Arg处理后,细胞生长良好。Arg对乳腺上皮细胞增殖具有明显的促进作用,与对照组相比,添加0.5倍(0.25mM/L)和1倍(0.5mM/L)的精氨酸在整个培养阶段对乳腺上皮细胞都具有促进增殖的作用。在试验初始阶段,各处理组细胞数量无差异(P0.05)；在第3天,与对照组相比,0.5倍和1倍处理组的细胞数量分别提高了17.6%(P0.05)和20.1%(P0.05)；在第5天0.5倍和1倍处理组的细胞数量比对照组分别高27.6%(P0.01)、29.3%(P0.01)；在第7天0.5倍和1倍处理组的细胞数量比对照组分别高33.1%(P0.01)和34.3%(P0.01),表明当精氨酸浓度添加量为0.5mM/L时对细胞生长有显著的促进作用,但是继续添加精氨酸对生长的促进作用不明显。Arg 2倍组中α-酪蛋白合成量高于其他各组(P0.05)。在Arg 0倍组到Arg 1倍组,随着精氨酸浓度的升高,α-酪蛋白的合成量也呈升高的趋势；在Arg2倍组到Arg8倍组,随着精氨酸浓度的升高,a-酪蛋白的合成量呈下降的趋势。p-酪蛋白的合成规律和αα-酪蛋白基本一致,当Arg2倍组时,p-酪蛋白的合成量最高,且与其他组相比差异显著(P0.05)。对于mTOR、S6K基因,Arg各处理组均上调了其表达,差异显著(P0.05),且在Arg 2倍组时各基因的相对表达量最高。对于4EBP1基因,Arg各处理组的表达均显著下调,说明Arg处理后抑制了其表达。4 Arg, Glu, Gin, Pro对母猪繁殖性能的影响参照已有研究的添加剂量,通过在依据NRC(2012)营养标准配制的怀孕母猪料与哺乳母猪料配方的基础上分别添加1%的Arg, Glu, Gln, Pro,评估四种功能性氨基酸的分别添加对母猪产仔数等繁殖性能指标的影响。日粮添加Arg, Glu, Gln有效改善了母猪的繁殖性能,与对照组相比,日粮添加Arg, Glu, Gln增加了窝产活仔数(P0.05)和初生窝重以及断奶重(P0.05),而日粮添加Pro对窝产仔数和初生窝重没有影响。日粮分别添加Arg, Glu, Gln, Pro对母猪平均日采食量无任何影响。与对照组相比,日粮分别添加Arg, Glu, Gln, Pro缩短了全期试验母猪发情间隔(P0.05)。精氨酸组提高全期母猪发情率4.11个百分点,但无显著差异(P0.05)。
【关键词】：功能性氨基酸 肠道上皮细胞 乳腺上皮细胞 蛋白周转 信号通路
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S828.5
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 第1章 文献综述14-25
• 1.1 功能性氨基酸的概念14-15
• 1.2 氨基酸与肠道健康15-18
• 1.2.1 精氨酸与肠道健康15-16
• 1.2.2 谷氨酸与肠道健康16
• 1.2.3 谷氨酰胺与肠道健康16-18
• 1.2.4 脯氨酸与肠道健康18
• 1.3 氨基酸对乳蛋白合成的调控18-24
• 1.3.1 支链氨基酸对乳蛋白合成的调控20-22
• 1.3.2 精氨酸对乳蛋白合成的调控22-23
• 1.3.3 谷氨酰胺和脯氨酸对乳蛋白合成的调控23-24
• 1.4 研究目的与意义24-25
• 第2章 泌乳性能差异母猪血清代谢组学分析25-36
• 2.1 材料与方法25-28
• 2.1.1 试验动物和日粮25-26
• 2.1.2 泌乳性能的评定分组与采样26
• 2.1.3 材料试剂26
• 2.1.4 样品处理26-27
• 2.1.5 LC/MS分析27-28
• 2.1.6 数据的分析28
• 2.2 结果分析28-33
• 2.2.1 PCA分析28-29
• 2.2.2 PLS-DA分析29-31
• 2.2.3 两组之间差异性代谢产物31-33
• 2.3 讨论33-35
• 2.4 小结35-36
• 第3章 ARG,GLU,GLN,PRO对肠上皮细胞蛋白质代谢及信号通路的影响36-45
• 3.1 材料与方法37-40
• 3.1.1 试验仪器37
• 3.1.2 试验试剂37
• 3.1.3 IPEC-1细胞培养37-38
• 3.1.4 试验操作38-39
• 3.1.5 数据统计分析39-40
• 3.2 结果与分析40-42
• 3.2.1 Arg,Glu,Gln,Pro对猪肠上皮细胞增殖的影响40
• 3.2.2 精氨酸对mTOR和PI3K-Akt-Bcl-2信号通路的影响40-42
• 3.3 讨论42-44
• 3.4 小结44-45
• 第4章 ARG对猪乳腺上皮细胞(PMEC)蛋白质合成及信号通路的影响45-53
• 4.1 材料与方法46-47
• 4.1.1 材料46
• 4.1.2 猪乳腺上皮细胞的培养和计数46
• 4.1.3 精氨酸对猪乳腺上皮细胞生长和细胞蛋白浓度的影响46
• 4.1.4 乳腺上皮细胞内αS-1、β-酪蛋白合成量的测定46-47
• 4.1.5 精氨酸对猪乳腺上皮细胞mTOR信号通路翻译起始因子基因表达的影响47
• 4.1.6 数据处理47
• 4.2 结果与分析47-51
• 4.2.1 精氨酸对猪乳腺上皮细胞增殖及蛋白浓度的影响47-48
• 4.2.2 精氨酸对猪乳腺上皮细胞内酪蛋白合成的影响48-49
• 4.2.3 精氨酸对猪乳腺上皮细胞mTOR信号通路信号分子mRNA基因表达的影响49-51
• 4.3 讨论51-52
• 4.3.1 精氨酸对猪乳腺上皮细胞增殖及蛋白合成的影响51-52
• 4.3.2 Arg对乳腺细胞中mTOR信号通路相关基因表达的影响52
• 4.4 小结52-53
• 第5章 日粮添加ARG,GLU,GLN,PRO对母猪繁殖性能的影响53-58
• 5.1 材料与方法53-55
• 5.1.1 试验动物及设计53
• 5.1.2 试验日粮53-54
• 5.1.3 饲养管理54
• 5.1.4 测定指标54-55
• 5.1.5 统计分析55
• 5.2 结果与分析55-56
• 5.2.1 日粮中添加Arg,Glu,Gln,Pro对母猪繁殖性能的影响55
• 5.2.2 日粮分别添加Arg,Glu,Gln,Pro对母猪采食量的影响55-56
• 5.2.3 日粮分别添加Arg,Glu,Gln,Pro对母猪全期发情间隔及断奶后56
• 5.3 讨论56-57
• 5.4 小结57-58
• 第6章 结论、创新性和展望58-59
• 6.1 主要结论58
• 6.2 创新性58
• 6.3 有待进一步研究的问题58-59
• 参考文献59-71
• 附表：缩写词表(ABBROVIATIONS)71-72
• 致谢72-73
• 作者简介73
• 攻读博士学位期间发表的学术论文和申请的专利73

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