水稻CRISPR/Cpf1基因编辑系统的建立与优化
发布时间：2021-04-17 07:46
CRISPR/Cas9技术自问世以来一直受到广泛的关注。科研人员建立了各个物种的CRISPR/Cas9系统;对系统的编辑效率、范围和编辑类型及多基因编辑等方面进行了优化;并且利用该系统实现了多物种的基因功能鉴定和品种改良等工作。而CRISPR/Cpf1技术是不同于CRISPR/Cas9的一种新的基因编辑技术。本研究论文主要建立了水稻农杆菌介导的CRISPR/Cpf1基因编辑系统、扩展了CRISPR/Cpf1系统的编辑范围、提高了系统的编辑效率并利用该系统实现了高效的多基因编辑。主要研究内容与结果如下:1、获得了水稻密码子优化的Os Lb Cpf1基因序列,构建了p HUN 611表达载体,选取了Os PDS和Os BEL基因作为靶基因,合成了不同长度的cr RNA,构建了6个靶标载体。农杆菌介导水稻稳定遗传转化获得T0植株,对T0植株进行阳性检测、T7E1检测和测序检测,获得了T0代突变植株。统计植株突变率得到cr RNA类型依次是Matrue cr RNA、Pre-cr RNA type I、Pre-cr RNA type II时,Os PDS基因的突变率分别为:0%、13.6%和2...
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
TALEN靶向基因方法
安徽农业大学博士学位论文第一章文献综述4示。图1-2CRISPR/Cas系统类型IIFig.1-2ThetypeIIofCRISPR/Cas1.2.3CRISPR/Cas系统类型II的作用机制CRISPR/Cas系统类型II在发挥作用时，除了CRISPR簇和Cas蛋白的参与外，还需要有crRNA和tracrRNA的参与[35-37]。在此类型中，发挥重要作用的是Cas9蛋白。Cas9蛋白不仅可以生产加工crRNA，而且可以切割外源DNA双链[38]。在细菌中，CRISPR/Cas系统由tracrRNA、crRNA、RNaseIII复合体以及Cas9蛋白组成。在细菌体内发挥免疫功能的分子机制大致可分为三步：第一步，对外源DNA的识别。细菌通过其识别外源DNA上的特殊片段——PAM，即原型间隔序列毗邻基序（protospacer-associationmotif），识别外源DNA。识别之后将PAM毗邻的间隔序列整合到细菌的基因组CRISPR序列中；第二步，crRNAs的形成。pre-crRNA由CRISPR簇转录而来，产生的pre-crRNA与tracrRNA，即trans-activatingcrRNA，结合形成复合体[34]。在Cas9的帮助下，该复合体被细菌自身的RNaseIII切割而成为成熟的crRNAs；第三步：CRISPR/Cas系统对外源DNA的切割。CrRNA、tracrRNA与Cas蛋白组成了一个三元复合体，在这个三元复合体的作用下，外源DNA双链首先被解链，一条链与crRNA链互补，另一条链游离在细菌体内。此时Cas9蛋白的两个功能位点，HNH位点对互补链实行剪切、而RuvC位点对非互补链实行剪切[39]，从而实现对外源DNA双链剪切，造成外源DNA在细菌体内的降解，发挥细菌的免疫功能。因为细菌的CRISPR/Cas免疫系统类型II所需的参与物质相对较少，所以研究者将类型II进
安徽农业大学博士学位论文第一章文献综述5行人为的改造，而使其可以应用于真核生物的靶向基因编辑[40-42]。真核生物体内含有内源性的RNA酶，从而在利用该系统时无需额外加入RNA酶[43]。为了使利用过程更加简单易行，科研工作者根据tracrRNA和crRNA的结构特性，设计出与其二聚体结构相似的单链引导RNA(sgRNA)。sgRNA同样可以特异的与Cas9蛋白相结合，并且引导其到特定的靶位点来实现DNA双链的剪切。最终实验室所利用的CRISPR/Cas系统是同时含有sgRNA识别域及Cas9蛋白剪切域的复合体（图1-3）。利用这一系统只需要在靶位点的设计时注意最后位点的PAM序列要求为NGG，即可实现几乎所有基因组的定向打靶。图1-3用于真核生物的CRISPR/Cas系统Fig.1-3TheCRISPR/Cassystemforeukaryon1.2.4CRISPR/Cas技术介导的基因突变CRISPR/Cas技术自从问世以来就得到广泛关注。在不到两年的时间里已经成功的应用于酵母等小型真核生物，果蝇[41]、斑马鱼[44]等动物以及拟南芥[45,46]、水稻[45]、小麦[47]等植物的靶向基因编辑。Jienk等[21]首次证明了CRISPR/Cas可以靶向任意DNA序列。2013年1月，Cong等[40]分别成功构建了两种不同类型的II型CRISPR/Cas系统，除此以外还证明了Cas9蛋白在短RNA复合体的指导下可以特异性的实现对人细胞和小鼠细胞DNA双链的剪切。Hwang等[48]人工优化的sgRNA指导的CRISPR/Cas系统成功地实现了斑马鱼胚胎中定点的DNA双链切割，通过该系统地作用，可以引起斑马鱼细胞中fh1、apoea等基因的定点突变，而且其突变效率与利用TALEN技术相当。Wang等[49]同样利用该技术在
【参考文献】：
期刊论文
[1]A CRISPR/Cas9 toolkit for efficient targeted base editing to induce genetic variations in rice[J]. Bin Ren,Fang Yan,Yongjie Kuang,Na Li,Dawei Zhang,Honghui Lin,Huanbin Zhou. Science China（Life Sciences）. 2017(05)
[2]CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis[J]. Yiyu Chen,Zhiping Wang,Hanwen Ni,Yong Xu,Qijun Chen,Linjian Jiang. Science China（Life Sciences）. 2017(05)
[3]Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cpf1 system[J]. Xixun Hu,Chun Wang,Qing Liu,Yaping Fu,Kejian Wang. Journal of Genetics and Genomics. 2017(01)
[4]Rapid improvement of grain weight via highly efficient CRISPR/Cas9-mediated multiplex genome editing in rice[J]. Rongfang Xu,Yachun Yang,Ruiying Qin,Hao Li,Chunhong Qiu,Li Li,Pengcheng Wei,Jianbo Yang. Journal of Genetics and Genomics. 2016(08)
本文编号：3143076
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
TALEN靶向基因方法
安徽农业大学博士学位论文第一章文献综述4示。图1-2CRISPR/Cas系统类型IIFig.1-2ThetypeIIofCRISPR/Cas1.2.3CRISPR/Cas系统类型II的作用机制CRISPR/Cas系统类型II在发挥作用时，除了CRISPR簇和Cas蛋白的参与外，还需要有crRNA和tracrRNA的参与[35-37]。在此类型中，发挥重要作用的是Cas9蛋白。Cas9蛋白不仅可以生产加工crRNA，而且可以切割外源DNA双链[38]。在细菌中，CRISPR/Cas系统由tracrRNA、crRNA、RNaseIII复合体以及Cas9蛋白组成。在细菌体内发挥免疫功能的分子机制大致可分为三步：第一步，对外源DNA的识别。细菌通过其识别外源DNA上的特殊片段——PAM，即原型间隔序列毗邻基序（protospacer-associationmotif），识别外源DNA。识别之后将PAM毗邻的间隔序列整合到细菌的基因组CRISPR序列中；第二步，crRNAs的形成。pre-crRNA由CRISPR簇转录而来，产生的pre-crRNA与tracrRNA，即trans-activatingcrRNA，结合形成复合体[34]。在Cas9的帮助下，该复合体被细菌自身的RNaseIII切割而成为成熟的crRNAs；第三步：CRISPR/Cas系统对外源DNA的切割。CrRNA、tracrRNA与Cas蛋白组成了一个三元复合体，在这个三元复合体的作用下，外源DNA双链首先被解链，一条链与crRNA链互补，另一条链游离在细菌体内。此时Cas9蛋白的两个功能位点，HNH位点对互补链实行剪切、而RuvC位点对非互补链实行剪切[39]，从而实现对外源DNA双链剪切，造成外源DNA在细菌体内的降解，发挥细菌的免疫功能。因为细菌的CRISPR/Cas免疫系统类型II所需的参与物质相对较少，所以研究者将类型II进
安徽农业大学博士学位论文第一章文献综述5行人为的改造，而使其可以应用于真核生物的靶向基因编辑[40-42]。真核生物体内含有内源性的RNA酶，从而在利用该系统时无需额外加入RNA酶[43]。为了使利用过程更加简单易行，科研工作者根据tracrRNA和crRNA的结构特性，设计出与其二聚体结构相似的单链引导RNA(sgRNA)。sgRNA同样可以特异的与Cas9蛋白相结合，并且引导其到特定的靶位点来实现DNA双链的剪切。最终实验室所利用的CRISPR/Cas系统是同时含有sgRNA识别域及Cas9蛋白剪切域的复合体（图1-3）。利用这一系统只需要在靶位点的设计时注意最后位点的PAM序列要求为NGG，即可实现几乎所有基因组的定向打靶。图1-3用于真核生物的CRISPR/Cas系统Fig.1-3TheCRISPR/Cassystemforeukaryon1.2.4CRISPR/Cas技术介导的基因突变CRISPR/Cas技术自从问世以来就得到广泛关注。在不到两年的时间里已经成功的应用于酵母等小型真核生物，果蝇[41]、斑马鱼[44]等动物以及拟南芥[45,46]、水稻[45]、小麦[47]等植物的靶向基因编辑。Jienk等[21]首次证明了CRISPR/Cas可以靶向任意DNA序列。2013年1月，Cong等[40]分别成功构建了两种不同类型的II型CRISPR/Cas系统，除此以外还证明了Cas9蛋白在短RNA复合体的指导下可以特异性的实现对人细胞和小鼠细胞DNA双链的剪切。Hwang等[48]人工优化的sgRNA指导的CRISPR/Cas系统成功地实现了斑马鱼胚胎中定点的DNA双链切割，通过该系统地作用，可以引起斑马鱼细胞中fh1、apoea等基因的定点突变，而且其突变效率与利用TALEN技术相当。Wang等[49]同样利用该技术在
【参考文献】：
期刊论文
[1]A CRISPR/Cas9 toolkit for efficient targeted base editing to induce genetic variations in rice[J]. Bin Ren,Fang Yan,Yongjie Kuang,Na Li,Dawei Zhang,Honghui Lin,Huanbin Zhou. Science China（Life Sciences）. 2017(05)
[2]CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis[J]. Yiyu Chen,Zhiping Wang,Hanwen Ni,Yong Xu,Qijun Chen,Linjian Jiang. Science China（Life Sciences）. 2017(05)
[3]Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cpf1 system[J]. Xixun Hu,Chun Wang,Qing Liu,Yaping Fu,Kejian Wang. Journal of Genetics and Genomics. 2017(01)
[4]Rapid improvement of grain weight via highly efficient CRISPR/Cas9-mediated multiplex genome editing in rice[J]. Rongfang Xu,Yachun Yang,Ruiying Qin,Hao Li,Chunhong Qiu,Li Li,Pengcheng Wei,Jianbo Yang. Journal of Genetics and Genomics. 2016(08)
本文编号：3143076
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