牙鲆原始生殖细胞的起源、增殖和迁移以及高温雄性化的机制研究

发布时间：2017-04-28 19:01

  本文关键词：牙鲆原始生殖细胞的起源、增殖和迁移以及高温雄性化的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：牙鲆Olive flounder(Paralichthys olivaceus)是我国重要的海水经济养殖品种,具有极高的营养价值和经济价值。牙鲆在养殖过程中雌性生长速度显著高于雄性,生产中,人们希望降低雄性的比例获得更高的经济效益。温度是影响鱼类性别分化重要的环境因子之一。高温可以导致鲆鲽类雄性比例显著增多,甚至达到100%雄性。因此研究温度对牙鲆性别分化的影响及其内在的机制对于丰富鱼类性别分化理论、完善鱼类生殖发育调控机制具有重要的意义。本研究克隆了牙鲆生殖细胞标记基因dnd并研究了其在胚胎发育和配子发生过程中的表达模式;克隆了基质细胞衍生因子sdf-1和趋化因子cxcr4,并研究了其在胚胎发育过程中的表达模式,比较了在不同温度处理条件下,其表达量的变化;比较了XX牙鲆在雄激素(17α-甲基睾酮)和高温(28℃)处理条件下,诱导率情况,全长情况,生殖细胞形态、数量增殖变化,生殖细胞标记基因(dnd)和雄性高表达基因(amh)在性分化过程中的表达量变化;比较了高温处理条件下,性分化过程中,抗缪勒氏管激素、雌二醇、睾酮和甲状腺激素的含量变化。主要研究结果如下:1)牙鲆生殖质是母源性的,Podnd基因能够用于标记PGCs在胚胎发育过程中的发生迁移模式;牙鲆PGCs起源和迁移模式和斑马鱼、大菱鲆相似;2)雄激素(17α-甲基睾酮),高温(28℃)在幼鱼全长1.2-1.3cm之间进行处理,均可以诱导XX牙鲆幼鱼雄性化:XX牙鲆雌性率为94.44%;雄激素处理,诱导率达到92.31%,同时显著抑制了幼鱼的生长;而高温在诱导雄性化的过程中,诱导率达到95.24%,较对照组而言,全长无显著性差异;3)牙鲆sdf-1和cxcr4主要在原肠期和体节期表达,符合PGCs迁移运动发生的时期特点,且在不同温度处理下,上述两个因子的表达量有显著变化,可能参与了其迁移调控的过程;4)在性分化过程中,未分化的性腺朝着雌性和雄性分化时,生殖细胞的数量和增殖方式呈现二态性,朝着雌性分化的群体生殖细胞数量显著高于雄性。同时,雄性的凋亡显著高于雌性,且雄性的凋亡呈现片状带型特征,雌性是点状零散型的特征,可能凋亡特点的不同参与了生殖细胞数量的差异;5)在性分化过程中,生殖细胞标记基因dnd,雄性高表达基因amh呈现出明显的性别二态性,雌性主导群体的dnd表达量显著高于雄性主导群体,同时,雌性主导群体的amh表达量显著低于雄性主导群体。
【关键词】：牙鲆(Paralichthys olivaceus) 性别分化 高温 雄激素 分子机制
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 致谢4-5
• 摘要5-7
• ABSTRACT7-15
• 第一章 文献综述15-32
• 1.1 鱼类原始生殖细胞胚胎期的发生发育研究进展15-18
• 1.1.1 鱼类PGCs的形态组织学、免疫组织化学和电镜超微结构特征15-16
• 1.1.2 鱼类PGCs标记基因及技术研究进展16
• 1.1.3 鱼类PGC(s)的起源16-17
• 1.1.4 鱼类PGC(s)迁移路线及机制研究进展17-18
• 1.1.5 环境因子对鱼类PGCs迁移的影响18
• 1.2 硬骨鱼类性腺的分化和发育研究进展18-26
• 1.2.1 硬骨鱼类性腺分化的判断标准研究进展19-21
• 1.2.1.1 性腺分化类型19-20
• 1.2.1.2 性腺分化的时间20
• 1.2.1.3 性别雌雄判断的标志20-21
• 1.2.2 鱼类性别分化与日龄和全长的关系21
• 1.2.3 抗缪勒氏管激素在性别分化中的作用研究21-23
• 1.2.4 生殖细胞在性别分化过程中的作用23-24
• 1.2.5 性别分化过程中相关基因的研究进展24-26
• 1.2.5.1 生殖细胞标记基因dnd24
• 1.2.5.2 P450arom24-25
• 1.2.5.3 foxl25-26
• 1.2.5.5 sox926
• 1.3 人工诱导鱼类性腺的分化26-29
• 1.3.1 人工诱导鱼类性分化的方式26-29
• 1.3.1.1 外源激素诱导鱼类性分化27
• 1.3.1.2 高温诱导鱼类雄性化27-28
• 1.3.1.3 药物诱导鱼类性腺的分化28-29
• 1.3.2 细胞凋亡与性别分化的关系29
• 1.4 牙鲆胚胎发育及性分化的研究进展29-30
• 1.4.1 牙鲆概述29
• 1.4.2 牙鲆胚胎发育及性分化研究进展29-30
• 1.5 本研究的意义及目的30-32
• 第二章 牙鲆原始生殖细胞的起源、增殖和迁移及在成熟性腺中的表达模式32-54
• 2.1 研究背景32-33
• 2.2 材料与方法33-40
• 2.2.1 实验材料33
• 2.2.2 主要仪器和试剂33-34
• 2.2.2.1 主要仪器33
• 2.2.2.2 主要试剂33-34
• 2.2.3 牙鲆原始生殖细胞标记基因dnd的克隆34-36
• 2.2.3.1 总RNA提取（RNA提取试剂盒）34
• 2.2.3.2 反转录cDNA第一链合成34
• 2.2.3.3 dnd部分片段的获得34-35
• 2.2.3.4 RACE获得dnd c DNA全长序列35-36
• 2.2.4 dnd序列分析及进化树构建36
• 2.2.5 dnd在牙鲆胚胎发育期及成鱼各组织的荧光定量检测36-37
• 2.2.6 dnd在牙鲆胚胎发育期及性腺的原位检测37-40
• 2.2.6.1 Podnd正义和反义探针合成37-38
• 2.2.6.2 切片原位杂交38-39
• 2.2.6.3 胚胎整体原位杂交39-40
• 2.2.7 数据统计40
• 2.3 结果40-51
• 2.3.1 dnd基因序列和进化关系分析40-42
• 2.3.2 牙鲆dnd成鱼各组织和胚胎发育时序表达情况42-44
• 2.3.3 牙鲆dnd基因在性腺中的表达定位44-46
• 2.3.4 牙鲆dnd基因在胚胎发育过程中的定位46-51
• 2.4 讨论51-54
• 2.4.1 牙鲆dnd基因的克隆和序列特征分析51-52
• 2.4.2 牙鲆dnd基因的成鱼各组织及在成熟性腺中的定位模式检测52
• 2.4.3 牙鲆dnd基因在胚胎期的表达模式分析52
• 2.4.4 牙鲆原始生殖细胞的迁移模式分析52-54
• 第三章 雄激素诱导牙鲆性分化过程中生殖细胞数量变化及相关基因差异表达研究54-74
• 3.1 研究背景54-55
• 3.2 材料与方法55-57
• 3.2.1 实验材料55
• 3.2.2 实验设计和取样55-56
• 3.2.3 主要仪器和试剂56
• 3.2.3.1 主要仪器56
• 3.2.3.2 主要试剂56
• 3.2.4 性分化关键期性腺组织学观察56
• 3.2.5 性分化关键期基因dnd和amh荧光定量PCR检测56-57
• 3.2.6 ELISA法检测激素含量57
• 3.2.7 数据统计57
• 3.3 结果57-71
• 3.3.1 牙鲆对照组和雄激素诱导组诱导率统计57-58
• 3.3.2 牙鲆性分化关键期对照组和雄激素诱导组幼鱼全长比较58-59
• 3.3.3 在性分化关键期，对照组和雄激素诱导组生殖细胞形态、分布和数量变化及增殖方式比较59-65
• 3.3.3.1 在性分化关键期，表型雌雄的生殖细胞形态及分布变化59-64
• 3.3.3.2 在性分化关键期中，表型雌雄的生殖细胞增殖规律64-65
• 3.3.4 性分化完成后，对照组和雄激素组，表型雌雄性腺组织学比较65-68
• 3.3.5 牙鲆性分化关键期相关基因的表达量变化68-71
• 3.3.5.1 dnd基因在性腺分化过程中的表达变化68-69
• 3.3.5.2 amh基因在各组织中的表达情况69-70
• 3.3.5.3 amh基因在性腺分化过程中的表达情况70-71
• 3.3.6 牙鲆性分化关键期抗缪勒氏管激素变化71
• 3.4 讨论71-73
• 3.4.1 外源添加17α-甲基睾酮诱导雄性化71-72
• 3.4.2 雄激素诱导对幼鱼生长的抑制作用72
• 3.4.3 amh基因和抗缪勒氏管激素的作用72-73
• 3.5 小结73-74
• 第四章 高温影响牙鲆原始生殖细胞迁移及雄性化过程中生殖细胞数量变化及相关基因差异表达74-109
• 4.1 研究背景74-76
• 4.2 高温影响牙鲆sdf-1 和cxcr4表达量的变化76-87
• 4.2.1 材料与方法76-78
• 4.2.1.1 实验设计及取样76
• 4.2.1.2 主要仪器和试剂76
• 4.2.1.3 牙鲆分泌和趋化因子sdf-1/cxcr4基因克隆76-77
• 4.2.1.4 序列分析及进化树构建77
• 4.2.1.5 实时荧光定量PCR检测77
• 4.2.1.6 数据统计77-78
• 4.2.2 结果78-86
• 4.2.2.1 牙鲆sdf-1 和cxcr4基因克隆和序列分析78-83
• 4.2.2.1.1 sdf-1 基因克隆和序列分析78-80
• 4.2.2.1.2 cxcr4基因克隆和序列分析80-83
• 4.2.2.2 牙鲆sdf-1 和cxcr4基因的组织特异性83-84
• 4.2.2.3 不同温度处理条件下，sdf-1 和cxcr4的表达变化84-86
• 4.2.3 讨论86-87
• 4.3 高温诱导牙鲆雄性化过程中生殖细胞数量和基因表达差异研究87-109
• 4.3.1 材料与方法87-88
• 4.3.1.1 实验材料87
• 4.3.1.2 实验设计和取样87
• 4.3.1.3 主要仪器和试剂87
• 4.3.1.4 凋亡检测87-88
• 4.3.1.5 数据统计88
• 4.3.2 结果88-106
• 4.3.2.1 对照组和高温诱导组的诱导率及全长比较88-89
• 4.3.2.2 性腺分化关键期性腺组织切片观察89-106
• 4.3.2.2.1 性分化关键期，对照组和高温诱导组的生殖细胞形态和分布变化89-96
• 4.3.2.2.2 性分化关键期，对照组和高温诱导组生殖细胞数量变化比较。96-97
• 4.3.2.2.3 性腺分化完成后，对照组和高温诱导组的性腺组织学比较97-101
• 4.3.2.2.4 凋亡相关检测101-102
• 4.3.2.2.5 性腺分化关键期，基因dnd和amh的表达情况检测102-103
• 4.3.2.2.6 性分化过程中，对照组和高温诱导组相关激素含量的变化103-106
• 4.3.3 讨论106-108
• 4.3.3.1 性别分化过程中，，生殖细胞数量呈现性别二态性106-107
• 4.3.3.2 凋亡在精巢和卵巢中呈现不同的分布特征107
• 4.3.3.3 amh和激素在高温雄性化中的作用107-108
• 4.3.4 小结108-109
• 第五章 结论与展望109-111
• 5.1 主要研究结论109-110
• 5.2 展望110-111
• 参考文献111-128
• 作者简介128-129
• 博士期间发表和完成的论文129

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  本文关键词：牙鲆原始生殖细胞的起源、增殖和迁移以及高温雄性化的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：333352