胸膜肺炎放线杆菌GalT蛋白免疫保护与促炎功能研究
发布时间：2021-09-06 00:32
胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP）的致病菌,该病原能引起猪的纤维素性胸膜炎和出血性肺炎,给世界养猪业带来巨大的经济损失。研究证明胸膜肺炎放线杆菌具有多种毒力因子,包括Apx分泌外毒素、脂多糖、荚膜多糖等。这些毒力因子都是体外培养条件下表达的,对APP体内诱导抗原的研究并不多。体内诱导抗原是病原菌在感染过程中特异表达的抗原,这些抗原在致病过程中发挥着重要作用。鉴定胸膜肺炎防线杆菌体内诱导表达抗原,有利于进一步揭示其感染的机制。本研究运用体内诱导抗原技术筛选到APP的体内诱导抗原,证明这些抗原在感染过程中优先表达。免疫学实验证明APP体内诱导抗原半乳糖代谢相关酶（GalT）能诱导有效的体液免疫和细胞免疫应答,是良好的免疫原。研究证明GalT刺激巨噬细胞能促进促炎性细胞因子的分泌,同时揭示了此过程中的信号转导通路。具体工作如下:1、APP体内诱导抗原GalT的鉴定及转录分析本研究使用运用体内诱导抗原技术（IVIAT）鉴定了APP感染过程中体...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：126 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
运用qRT-PCR分析体内诱导抗原体内外表达水平差异
图 2.1 利用生物信息学方法预测活体诱导抗原的抗原特性Fig 2.1Antigenic properties of the in vivo-induced antigens predicted using a bioinformatics approach.1.6 体内诱导抗原重组表达菌株的构建从 NCBI 数据库中检索体内诱导抗原基因并保存。使用 Primer Premier 5 软件设计克隆这些基因序列的引物。这些体内诱导抗原基因序列的引物的具体内容，包括序列和产物等内容见表 2.1。在这些引物序列中，带有下划线的核苷酸序列代表添加的限制性酶切位点。于 TSB 中 37℃过夜培养 APP L20 菌株，使用基因组提取试剂盒抽提 APP 基因组 DNA。以抽提的基因组 DNA 为模板，用 PCR 方法扩增六个体内诱导抗原的基因。使用相应的限制性内切酶对扩增序列和 pET-28a 进行酶切。用 T4 DNA连接酶连接扩增序列片段和暴露酶切位点的 pET-28a，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α。用 PCR 扩增和限制性酶切分析方法证明重组子，并对插入序列进行测序分析。用 BLAST 对测序结果进行进一步比对分析。
2 结果2.1 重组蛋白的表达与免疫印迹分析PCR 扩增表达重组蛋白菌株的基因序列，测序和用限制性酶切分析。PCR、测限制性酶切分析证明，PCR 扩增片段和酶切结果获得了预期大小片段，测序结明该片段序列与 L20 菌株基因组序列一致。将重组质粒成功转化进大肠杆菌 BL达菌株，并成功表达了组氨酸标签融合蛋白。SDS-PAGE 电泳结果表明大肠杆菌达出来预期大小的融合蛋白。用镍离子亲和层析方法纯化重组融合蛋白，DS-PAGE 电泳分析纯化结果(图 2.2A)。运用重组蛋白抗血清进行免疫印迹分析。个体内诱导抗原的 SDS-PAGE 电泳结果对比(图 2.2A)，在免疫印迹结果上相应大置均有相应的反应条带(图 2.2B)。结果表明，这些蛋白均能与相应的抗血清反应这些蛋白具有抗原性能够诱导动物产生 IgG。A. B.
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪胸膜肺炎放线杆菌菌影的制备与免疫试验[J]. 杜崇涛,李林溪,雷连成,张守勤,韩文瑜,王文东. 中国兽医学报. 2012(10)
[2]表达ApxIA的血清7型胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株的构建及特性分析[J]. 刘金林,陈砚,胡琳琳,贝为成,陈焕春. 生物工程学报. 2010(03)
[3]增强猪传染性胸膜肺炎灭活苗对小鼠保护力的研究[J]. 王勇,刘思国,王春来,邵美丽,刘建东,宫强,迟磊,赵昆,郭设平,车广头. 中国预防兽医学报. 2007(06)
[4]猪胸膜肺炎调查及地方适用型灭活疫苗的研制[J]. 叶润全,冼琼珍,麦志均,陈理,顾万军. 畜牧与兽医. 2007(01)
[5]猪胸膜肺炎放线杆菌脂多糖的制备及对小鼠的免疫保护作用[J]. 刘霞,刁有祥,禚宝山,于申业,鞠洪涛. 中国预防兽医学报. 2006(05)
[6]重组ApxⅡA对胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗免疫效果的影响[J]. 王春来,刘思国,邵美丽,王勇,宫强,郭设平,刘建东,赵昆,迟磊. 中国兽医科学. 2006(06)
[7]新型基因工程亚单位菌苗对猪传染性胸膜肺炎的保护效力研究[J]. 刘建杰,陈焕春,李冲,何启盖,吴斌. 中国农业科学. 2005(03)
硕士论文
[1]猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及其核酸疫苗的初步研究[D]. 彭娟.四川农业大学 2011
本文编号：3386374
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：126 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
运用qRT-PCR分析体内诱导抗原体内外表达水平差异
图 2.1 利用生物信息学方法预测活体诱导抗原的抗原特性Fig 2.1Antigenic properties of the in vivo-induced antigens predicted using a bioinformatics approach.1.6 体内诱导抗原重组表达菌株的构建从 NCBI 数据库中检索体内诱导抗原基因并保存。使用 Primer Premier 5 软件设计克隆这些基因序列的引物。这些体内诱导抗原基因序列的引物的具体内容，包括序列和产物等内容见表 2.1。在这些引物序列中，带有下划线的核苷酸序列代表添加的限制性酶切位点。于 TSB 中 37℃过夜培养 APP L20 菌株，使用基因组提取试剂盒抽提 APP 基因组 DNA。以抽提的基因组 DNA 为模板，用 PCR 方法扩增六个体内诱导抗原的基因。使用相应的限制性内切酶对扩增序列和 pET-28a 进行酶切。用 T4 DNA连接酶连接扩增序列片段和暴露酶切位点的 pET-28a，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α。用 PCR 扩增和限制性酶切分析方法证明重组子，并对插入序列进行测序分析。用 BLAST 对测序结果进行进一步比对分析。
2 结果2.1 重组蛋白的表达与免疫印迹分析PCR 扩增表达重组蛋白菌株的基因序列，测序和用限制性酶切分析。PCR、测限制性酶切分析证明，PCR 扩增片段和酶切结果获得了预期大小片段，测序结明该片段序列与 L20 菌株基因组序列一致。将重组质粒成功转化进大肠杆菌 BL达菌株，并成功表达了组氨酸标签融合蛋白。SDS-PAGE 电泳结果表明大肠杆菌达出来预期大小的融合蛋白。用镍离子亲和层析方法纯化重组融合蛋白，DS-PAGE 电泳分析纯化结果(图 2.2A)。运用重组蛋白抗血清进行免疫印迹分析。个体内诱导抗原的 SDS-PAGE 电泳结果对比(图 2.2A)，在免疫印迹结果上相应大置均有相应的反应条带(图 2.2B)。结果表明，这些蛋白均能与相应的抗血清反应这些蛋白具有抗原性能够诱导动物产生 IgG。A. B.
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪胸膜肺炎放线杆菌菌影的制备与免疫试验[J]. 杜崇涛,李林溪,雷连成,张守勤,韩文瑜,王文东. 中国兽医学报. 2012(10)
[2]表达ApxIA的血清7型胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株的构建及特性分析[J]. 刘金林,陈砚,胡琳琳,贝为成,陈焕春. 生物工程学报. 2010(03)
[3]增强猪传染性胸膜肺炎灭活苗对小鼠保护力的研究[J]. 王勇,刘思国,王春来,邵美丽,刘建东,宫强,迟磊,赵昆,郭设平,车广头. 中国预防兽医学报. 2007(06)
[4]猪胸膜肺炎调查及地方适用型灭活疫苗的研制[J]. 叶润全,冼琼珍,麦志均,陈理,顾万军. 畜牧与兽医. 2007(01)
[5]猪胸膜肺炎放线杆菌脂多糖的制备及对小鼠的免疫保护作用[J]. 刘霞,刁有祥,禚宝山,于申业,鞠洪涛. 中国预防兽医学报. 2006(05)
[6]重组ApxⅡA对胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗免疫效果的影响[J]. 王春来,刘思国,邵美丽,王勇,宫强,郭设平,刘建东,赵昆,迟磊. 中国兽医科学. 2006(06)
[7]新型基因工程亚单位菌苗对猪传染性胸膜肺炎的保护效力研究[J]. 刘建杰,陈焕春,李冲,何启盖,吴斌. 中国农业科学. 2005(03)
硕士论文
[1]猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及其核酸疫苗的初步研究[D]. 彭娟.四川农业大学 2011
本文编号：3386374
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