水稻RF6的表达纯化及其互作蛋白OsHXK6的结构研究
发布时间：2021-10-11 04:50
细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility,CMS）是指雄蕊发育异常,不能产生正常的雄性配子,而雌蕊发育正常能够接受正常花粉而受精结实的一种自然现象,植物界中普遍存在。CMS的育性可以被核基因组中的恢复基因（restorer of fertility,Rf）恢复。红莲型细胞质雄性不育（HL-CMS）属于配子体不育,其不育性可被两个恢复基因Rf5和Rf6分别独立恢复,它们均属于PPR基因家族。Rf6编码一个含894个氨基酸的P家族PPR（pentatricopeptide repeat protein）蛋白,一共含有20个PPR基序,并且PPR基序3,4,5以一个单元的形式在原位重复了一次。而其等位基因rf6的PPR基序3,4,5却未发生重复,丧失了恢复不育性的分子生物学功能。研究表明,这三个重复的PPR基序对于HL-CMS的育性恢复至关重要。由此推测,RF6和rf6两者在结构上势必有很大的差异。同时,研究表明,水稻己糖激酶6（OsHXK6）为HL-CMS的育性恢复复合体成员之一,能够在体内外与RF6互作。除此之外,己糖激酶（HXK）本身是一类多功能蛋白,是植物...
【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：131 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
不同农作物的CMS基因结构示意图(ChenandLiu,2014)
武汉大学博士学位论文10层中积累，因此是在翻译后水平对CMS进行育性恢复(Luoetal.,2013)。WA-CMS的作用机制模式如图1-2所示。图1-2WA-CMS作用机制模式图(Luoetal.,2013)1.1.3.3HL-CMS上个世纪七十年代，武汉大学利用海南红芒野生稻和江西地方品种莲塘早杂交，并经过多代回交，选育出了一种稳定的不育系，称为HL-CMS。HL-CMS属于配子体不育，花粉败育发生在二核期。与BT-CMS相似，CMS基因orfH79位于B-atp6基因下游，而且orfH79与orf79的序列高达98%，ORFH79也对大肠杆菌具有毒性作用(Pengetal.,2010)。此外，ORFH79能与P61相互作用，导致线粒体复合体Ⅲ活性降低，ROS水平上升，ATP合成减少，从而使花粉败育(Pengetal.,2010,Wanetal.,2007,Wangetal.,2013,Huetal.,2014)。HL-CMS中有Rf5和Rf6两个恢复基因，分别位于10号和8号染色体(Huetal.,2012,Huangetal.,2015)，Rf5与BT-CMS的Rf1a为同一基因，但是恢复机理却各异。Rf1a直接与不育基因转录本结合，而Rf5和Rf6都不能直接与不育基因转录本结合，它们都是以蛋白质复合体的形式来对转录本进行切割(Huangetal.,2015,Huetal.,2012,Qinetal.,2016)。RF5与GRP162，RFC2，RFC3，RFC4等蛋白质形成一个大小为400-500kDa的蛋白质复合体。GRP162为甘氨酸富含蛋白质，含有RNA识别以及结合的RRM结构域，能够与不育转录本结合；RFC2为V型ATP酶的亚基，是一个在恢复通路上与GRP162运输有关的线粒体膜蛋白，可以将复合体锚定在线粒体膜上（黄齐，2014）；RFC3是一个含WD40和DUF1620结构域的蛋白质，能同时与RF5和GRP162相互作用；RFC4含有ERCC4结构域，具有核酸酶活性，能够在体内和体外对不育转录本进行切割（秦晓健，2015），进而加工成小的转录本使得ORFH79不能成功翻译，从而实现育性的恢复(Hueta
武汉大学博士学位论文12族序列后的排列顺序为E–E+–DYW，E+基序必须排在E的后面，DYW必须排在E–E+后面(Lurinetal.,2004)。之后，Cheng等人利用结构模型构建的方法，在Lurin等人最早定义的PPR基序基础上，进行了重新定义(Chengetal.,2016)（图1-3）。随着对PPR蛋白的不断深入研究发现，有的P家族PPR的C端含有具有催化活性的序列，比如C端含有金属核酸酶结构域的PRORP蛋白(Holzmannetal.,2008,Pinkeretal.,2013)，C端含有LAGLIDADG结构域的PPR-LAGLIDADG(O"Tooleetal.,2008,deLongevialleetal.,2008)，最近发现的融合了Muts相关结构域（SMR）的PPR-SMR(Liuetal.,2013,Zoschkeetal.,2012,Zoschkeetal.,2013a)，以及融合了TGM（tRNAguanine-N7methyltransferase）的PPR-TGM(MannaandBarth,2013)。不同类型的PPR亚家族，行使的功能也不同，我们在后面进行详细讨论。图1-3PPR蛋白的分类(Chengetal.,2016)1.2.2PPR蛋白的结构PPR属于α-螺旋家族蛋白，由α-螺旋重复串联而成。Yinetal.（2013）解析了来自玉米叶绿体的结合以及未结合底物RNA的PPR10的晶体结构。PPR10属于P家族，含有19个PPR基序。从整体构象来看，PPR10为一个右手超螺旋结构。每个PPR基序形成两个α螺旋，分别命名为helix-a和helix-b，每个螺旋包含四个螺旋转，helix-b后面跟着由5个氨基酸形成的loop环，用来连接下一个PPR基序。helix-a和helix-b由两个氨基酸形成的短转角相连。每个重复基序的helix-a和helix-b分别形成超螺旋的内层和外层（图1-4）。在结合了含18个碱基的PSAJRNA
【参考文献】：
期刊论文
[1]杂交水稻研究50年[J]. 朱英国. 科学通报. 2016(35)
[2]高等植物己糖激酶基因研究进展[J]. 张超,王彦杰,付建新,王晓庆,王玮然,董丽. 生物技术通报. 2012(04)
[3]野败型水稻细胞质雄性不育恢复基因Rf-4的分子标记定位[J]. 张群宇,刘耀光,张桂权,梅曼彤. 遗传学报. 2002(11)
博士论文
[1]红莲型CMS水稻RF5通过形成核酸内切酶复合体恢复育性的研究[D]. 秦小健.武汉大学 2015
[2]红莲型CMS水稻RF5恢复复合体及成员RCF2的功能研究[D]. 黄齐.武汉大学 2014
本文编号：3429818
【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：131 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
不同农作物的CMS基因结构示意图(ChenandLiu,2014)
武汉大学博士学位论文10层中积累，因此是在翻译后水平对CMS进行育性恢复(Luoetal.,2013)。WA-CMS的作用机制模式如图1-2所示。图1-2WA-CMS作用机制模式图(Luoetal.,2013)1.1.3.3HL-CMS上个世纪七十年代，武汉大学利用海南红芒野生稻和江西地方品种莲塘早杂交，并经过多代回交，选育出了一种稳定的不育系，称为HL-CMS。HL-CMS属于配子体不育，花粉败育发生在二核期。与BT-CMS相似，CMS基因orfH79位于B-atp6基因下游，而且orfH79与orf79的序列高达98%，ORFH79也对大肠杆菌具有毒性作用(Pengetal.,2010)。此外，ORFH79能与P61相互作用，导致线粒体复合体Ⅲ活性降低，ROS水平上升，ATP合成减少，从而使花粉败育(Pengetal.,2010,Wanetal.,2007,Wangetal.,2013,Huetal.,2014)。HL-CMS中有Rf5和Rf6两个恢复基因，分别位于10号和8号染色体(Huetal.,2012,Huangetal.,2015)，Rf5与BT-CMS的Rf1a为同一基因，但是恢复机理却各异。Rf1a直接与不育基因转录本结合，而Rf5和Rf6都不能直接与不育基因转录本结合，它们都是以蛋白质复合体的形式来对转录本进行切割(Huangetal.,2015,Huetal.,2012,Qinetal.,2016)。RF5与GRP162，RFC2，RFC3，RFC4等蛋白质形成一个大小为400-500kDa的蛋白质复合体。GRP162为甘氨酸富含蛋白质，含有RNA识别以及结合的RRM结构域，能够与不育转录本结合；RFC2为V型ATP酶的亚基，是一个在恢复通路上与GRP162运输有关的线粒体膜蛋白，可以将复合体锚定在线粒体膜上（黄齐，2014）；RFC3是一个含WD40和DUF1620结构域的蛋白质，能同时与RF5和GRP162相互作用；RFC4含有ERCC4结构域，具有核酸酶活性，能够在体内和体外对不育转录本进行切割（秦晓健，2015），进而加工成小的转录本使得ORFH79不能成功翻译，从而实现育性的恢复(Hueta
武汉大学博士学位论文12族序列后的排列顺序为E–E+–DYW，E+基序必须排在E的后面，DYW必须排在E–E+后面(Lurinetal.,2004)。之后，Cheng等人利用结构模型构建的方法，在Lurin等人最早定义的PPR基序基础上，进行了重新定义(Chengetal.,2016)（图1-3）。随着对PPR蛋白的不断深入研究发现，有的P家族PPR的C端含有具有催化活性的序列，比如C端含有金属核酸酶结构域的PRORP蛋白(Holzmannetal.,2008,Pinkeretal.,2013)，C端含有LAGLIDADG结构域的PPR-LAGLIDADG(O"Tooleetal.,2008,deLongevialleetal.,2008)，最近发现的融合了Muts相关结构域（SMR）的PPR-SMR(Liuetal.,2013,Zoschkeetal.,2012,Zoschkeetal.,2013a)，以及融合了TGM（tRNAguanine-N7methyltransferase）的PPR-TGM(MannaandBarth,2013)。不同类型的PPR亚家族，行使的功能也不同，我们在后面进行详细讨论。图1-3PPR蛋白的分类(Chengetal.,2016)1.2.2PPR蛋白的结构PPR属于α-螺旋家族蛋白，由α-螺旋重复串联而成。Yinetal.（2013）解析了来自玉米叶绿体的结合以及未结合底物RNA的PPR10的晶体结构。PPR10属于P家族，含有19个PPR基序。从整体构象来看，PPR10为一个右手超螺旋结构。每个PPR基序形成两个α螺旋，分别命名为helix-a和helix-b，每个螺旋包含四个螺旋转，helix-b后面跟着由5个氨基酸形成的loop环，用来连接下一个PPR基序。helix-a和helix-b由两个氨基酸形成的短转角相连。每个重复基序的helix-a和helix-b分别形成超螺旋的内层和外层（图1-4）。在结合了含18个碱基的PSAJRNA
【参考文献】：
期刊论文
[1]杂交水稻研究50年[J]. 朱英国. 科学通报. 2016(35)
[2]高等植物己糖激酶基因研究进展[J]. 张超,王彦杰,付建新,王晓庆,王玮然,董丽. 生物技术通报. 2012(04)
[3]野败型水稻细胞质雄性不育恢复基因Rf-4的分子标记定位[J]. 张群宇,刘耀光,张桂权,梅曼彤. 遗传学报. 2002(11)
博士论文
[1]红莲型CMS水稻RF5通过形成核酸内切酶复合体恢复育性的研究[D]. 秦小健.武汉大学 2015
[2]红莲型CMS水稻RF5恢复复合体及成员RCF2的功能研究[D]. 黄齐.武汉大学 2014
本文编号：3429818
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