苹果MdWRKY33基因在轮纹病抗性形成中的作用机制研究

发布时间：2017-05-13 23:05

  本文关键词：苹果MdWRKY33基因在轮纹病抗性形成中的作用机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：苹果轮纹病是制约我国苹果产业发展的重要病害之一,由致病真菌Botryosphaeria dothidea引起。该病菌不仅能够侵染枝干,导致树体衰弱,还能侵染果实,形成同心轮纹病斑致果实腐烂；同时由于该病菌的潜伏特性,使苹果轮纹病成为果实贮运期的重要病害之一,致使苹果产量和品质急剧下降,造成严重的经济损失。植物在与病原菌漫长的协同进化过程中形成了极为复杂的抗病与免疫反应机制,使其能够针对特定病原菌的入侵而相应地激发植物抗病反应。经典的植物病理学研究表明：植物抗营活体寄生菌主要依赖于水杨酸信号转导途径,而抗营腐体寄生菌主要依赖于茉莉酸／乙烯信号转导途径。轮纹病菌属于兼性寄生菌,目前对该病菌与苹果互作的分子机制研究以及该病菌入侵后引起的抗病反应的研究,报道较少。因此,开展轮纹病菌与苹果果实互作的分子机制研究,对苹果抗病基因的挖掘、轮纹病菌防治机理的丰富和抗轮纹病新品种的培育均具有重要意义。本文以易感品种‘富士’果实为试材,首先研究了轮纹病菌B.dothidea在苹果果实中的扩展方式以及对苹果果实细胞的伤害；其次研究了乙烯信号分子在苹果果实发病中的作用,发现了乙烯在苹果果实与轮纹病菌互作中作为致病因子,促进果实发病；此外还发现转录因子MdWRKY33参与调控了苹果病程相关基因MdPRs的表达,并且介导了乙烯的致毒作用。主要研究结果如下：1.运用半薄切片与扫描电镜技术研究发现,B.dothidea侵入果实细胞后,菌丝大量存在于植物细胞壁与细胞间隙中。细胞壁降解为受B.dothidea侵染的苹果果实细胞的典型受害症状；部分受害细胞发生质壁分离；核染色质浓缩并聚集于核膜上,呈典型细胞凋亡症状。2.乙烯在轮纹病发病过程中作为致毒因子促进苹果果实发病。对不同成熟度与生理状态的三批果实,即‘富士’幼果、新鲜成熟果实与储藏果实,接种轮纹病菌后,施用乙烯抑制剂1-MCP,能够显著抑制果实发病；1-MCP对病斑的抑制作用呈现显著的浓度依赖性,1-MCP浓度越高,抑制作用越明显；相同浓度1-MCP对成熟果实病斑扩展的抑制效果最好；用外源乙烯预处理能够促进果实病斑扩展。3.在乙烯抑制剂1-MCP处理下,苹果病程相关基因MdPRs的表达进一步升高。B.dothidea能够诱导‘富士’幼果和新鲜成熟果中MdPR-5、MdPR-8和MdPR-4基因的表达,当用1-MCP处理接菌果实,病菌侵染诱导的MdPRs基因的表达进一步增强；而在储藏成熟果实中,轮纹病菌侵染却抑制了MdPRs基因的表达,1-MCP处理能够完全逆转轮纹病菌对MdPRs基因的抑制作用。此外,编码几丁质酶的MdChiB-1基因在幼果中不被轮纹病菌诱导,用1-MCP处理之后,其表达在轮纹病菌侵染下显著升高；新鲜成熟果实在1-MCP处理下,该基因的表达在轮纹病菌侵染下也进一步增强;而在储藏果实中,轮纹病菌对该基因的抑制作用被去除。因此,在1-MCP处理下,苹果病程相关基因MdPRs表达水平进一步升高,可能是增强苹果抗病能力,限制病斑扩展的重要因素。4.苹果转录因子MdWRKY33-1(MDP0000296025)的表达与病程相关基因MdPRs的表达高度协同。通过对19个转录因子做RT-PCR分析发现,B.dothidea只能诱导幼果中乙烯信号转录因子MdERF2的表达并且对幼果中MdERF3、MdERF98-3、MdERF98-6和MdERF98.7的诱导作用比对成熟果显著,1-MCP处理能抑制B.dothidea对ERFs的诱导表达；只有转录因子MdWRKY33-1的表达在接菌果实的乙烯合成和信号转导途径被抑制时,表达进一步升高,与MdPRs表达变化高度协同——在幼果中变化不大,在成熟果中表达量进一步升高,在储藏果中的表达抑制被解除；在各种激素和过氧化物等非生物胁迫下, ‘嘎啦’组培苗中的MdWRKY33-1与MdChiB-1、MdPR-5、MdPR-8、 MaPR-4这些MdPRs的表达变化也表现出了高度协同。5.MdWRKY33-1过表达能提高病程相关蛋白基因MdPRs的表达。转化苹果原生质体过表达ERFs和MdWRKY33转录因子,发现只有MdWRKY33-1能明显提高MdPRs的表达,说明MdWRKY33-1对MdPRs的表达起调控作用。6.在苹果果实中,轮纹病菌所诱导的乙烯合成途径与果实成熟过程中的乙烯合成途径不同。B.dothidea诱导的乙烯合成是通过影响MdACS5a,MdACS5b的表达来实现,与苹果果实成熟过程中乙烯的合成途径不同(MdACS1,MdACS3)。通过RT-PCR技术分析发现,负责介导由伤害胁迫引发的植物乙烯合成中的MdACS5a和MdACS5b基因的表达,能被轮纹病菌显著诱导,但轮纹病菌不能诱导负责果实成熟过程中乙烯合成与跃变的MdACS1和MdACS3的表达,说明B.dothidea诱导的果实乙烯合成与苹果果实成熟过程中的乙烯合成不同。乙烯受体基因MdERS1、MdERS2只在幼果中被B.dothidea诱导,在成熟果实中不被诱导,1-MCP处理能够抑制B.dothidea对它们的诱导作用；类似地,轮纹病菌对幼果乙烯受体基因MdETR2、乙烯转录因子MdERF98等的诱导比对成熟果显著,1-MCP处理均能显著抑制这些基因的表达,表明B.dothidea诱导的乙烯信号转导途径的调控与果实成熟进程有关。严格依赖乙烯的与果实成熟相关的MdPG1基因也能被轮纹病菌诱导,并受1-MCP显著抑制,进一步证实苹果果实响应轮纹病菌的乙烯信号转导与果实成熟进程有关。
【关键词】：苹果果实 轮纹病菌 乙烯 抗病性 MdWRKY33 MdPRs
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S436.611.1
【目录】：

• 中英文缩略词表5-11
• 中文摘要11-14
• Abstract14-17
• 1 前言17-40
• 1.1 苹果轮纹病研究进展17-22
• 1.1.1 苹果轮纹病的发生与危害17-18
• 1.1.2 苹果轮纹病菌的侵染过程及发病诱因18-19
• 1.1.3 病原菌致病机制19-20
• 1.1.4 植物抗病机制20-22
• 1.1.4.1 免疫反应20-21
• 1.1.4.2 WRKY转录因子在植物抗病反应中的作用21-22
• 1.2 乙烯在不同植病互作体系中的作用22-26
• 1.2.1 乙烯的调控在不同植病互作体系中具有不同的意义23-24
• 1.2.2 不同激素信号途径的交叉作用24-25
• 1.2.3 乙烯在分子水平上的调控25-26
• 1.3 乙烯生物合成26-29
• 1.3.1 乙烯生物合成途径及系统26
• 1.3.2 乙烯生物合成相关酶26-28
• 1.3.2.1 SAM合成酶和SAM水解酶26-27
• 1.3.2.2 ACC合成酶和ACC氧化酶27-28
• 1.3.3 苹果乙烯生物合成研究进展28-29
• 1.4 乙烯信号转导29-34
• 1.4.1 乙烯信号转导线性模型建立29
• 1.4.2 乙烯受体及其对乙烯信号的感知29-30
• 1.4.3 乙烯在胞质内的信号转导30-31
• 1.4.3.1 CTR1的功能30
• 1.4.3.2 EIN2的功能30-31
• 1.4.4 乙烯在核内的信号转导31-33
• 1.4.4.1 初级转录因子(EIN3/EIL)31
• 1.4.4.2 次级转录因子(ERF/AP2)的结构功能及对病原菌的响应31-33
• 1.4.5 苹果乙烯信号转导研究进展33-34
• 1.5 病程相关蛋白基因34-39
• 1.5.1 病程相关蛋白的分类与功能35-36
• 1.5.2 苹果中病程相关蛋白的研究进展36-39
• 1.5.2.1 MdPR-436-37
• 1.5.2.2 MdPR-1a,MdPR-5和MdPR-837-39
• 1.6 研究的目的和意义39
• 1.7 研究的主要内容39-40
• 2 材料和方法40-54
• 2.1 试验材料40-43
• 2.1.1 植物材料40
• 2.1.2 苹果轮纹病病原菌Botryospheria dothidea40
• 2.1.3 菌株和质粒40
• 2.1.4 酶及生化试剂40
• 2.1.5 PCR引物40-41
• 2.1.6 培养基41-42
• 2.1.7 抗生素42
• 2.1.8 溶液配制42-43
• 2.1.8.1 MS培养基配制所用溶液42
• 2.1.8.2 质粒DNA提取所用溶液42
• 2.1.8.3 原生质体分离与转化所用溶液42-43
• 2.1.8.4 Western Blot所用溶液43
• 2.2 试验方法43-54
• 2.2.1 苹果轮纹病病原菌Botryospheria dothidea的培养与保存43-44
• 2.2.2 乙烯释放量的测定44
• 2.2.3 半薄切片制片与扫描电镜观察44
• 2.2.4 总RNA提取44-46
• 2.2.5 反转录cDNA第一链的合成46
• 2.2.6 基因组DNA的提取及纯化46-47
• 2.2.7 普通PCR反应47
• 2.2.8 Real-time PCR47-48
• 2.2.9 基因克隆PCR48
• 2.2.10 PCR产物的回收48-49
• 2.2.11 连接反应49
• 2.2.12 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化49-50
• 2.2.12.1 大肠杆菌感受态细胞的制备49-50
• 2.2.12.2 大肠杆菌感受态细胞转化50
• 2.2.13 DNA序列测定50
• 2.2.14 序列分析50
• 2.2.15 质粒DNA提取50-51
• 2.2.16 质粒DNA酶切51
• 2.2.17 原生质体的分离与转化51-52
• 2.2.18 Western Blot52-54
• 2.2.18.1 蛋白样品的制备52
• 2.2.18.2 SDS-PAGE电泳52
• 2.2.18.3 转膜52-53
• 2.2.18.4 免疫反应53
• 2.2.18.5 显影与定影(暗室操作)53
• 2.2.18.6 凝胶图像分析53-54
• 3 结果与分析54-80
• 3.1 轮纹病菌侵染后苹果细胞学研究54-59
• 3.1.1 轮纹病菌对苹果果实细胞壁的影响54-56
• 3.1.2 轮纹病菌对苹果果实细胞器的影响56-58
• 3.1.3 轮纹病菌对苹果果实细胞核的影响58-59
• 3.2 轮纹病菌对苹果果实MAPK活性的影响59-60
• 3.3 乙烯与苹果轮纹病的关系60-68
• 3.3.1 1-MCP对接种轮纹病菌果实乙烯生物合成和病斑大小的影响60-62
• 3.3.2 1-MCP对乙烯生物合成和乙烯信号感知相关基因的影响62-66
• 3.3.3 1-MCP对病程相关基因MdPRs的影响66-68
• 3.4 MdWRKY33的表达受乙烯负调控68-75
• 3.4.1 1-MCP对转录因子的影响68-73
• 3.4.2 外源乙烯对MdWRKY33的影响73-75
• 3.5 MdWRKY33与MdPRs的关系75-80
• 3.5.1 MdWRKY33与MdPRs的表达高度协同75-76
• 3.5.2 MdPRs启动子分析76-78
• 3.5.3 原生质体转化验证78-80
• 4 讨论80-90
• 4.1 轮纹病菌在苹果果实中的侵染方式及致病机制80-82
• 4.1.1 轮纹病菌在苹果果实中的扩展方式及对果实细胞壁的破坏80-81
• 4.1.2 线粒体对病菌侵染较为敏感81-82
• 4.1.3 轮纹病菌诱导细胞凋亡82
• 4.2 乙烯与苹果轮纹病的关系82-86
• 4.2.1 乙烯促进苹果轮纹病菌发病82-84
• 4.2.2 苹果轮纹病菌诱导的乙烯信号途径与果实成熟进程有交叉作用84-86
• 4.3 MdWRKY33介导乙烯对MdPRs的负调控86-88
• 4.3.1 MdWRKY33与MdPRs表达高度协同86-87
• 4.3.2 MdWRKY33调控MdPRs的表达87-88
• 4.4 MdWRKY33调控MdPRs的猜测模型88-90
• 5 结论90-91
• 6 创新点91-92
• 7 参考文献92-117
• 8 附录117-124
• 8.1 取样示意图117
• 8.2 荧光定量所用引物117-121
• 8.3 构建载体所用引物121-122
• 8.4 补充图表122-124
• 9 致谢124-125
• 10 攻读学位期间发表论文情况125

  本文关键词：苹果MdWRKY33基因在轮纹病抗性形成中的作用机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：363800