猪骨骼肌生长发育过程中顺式天然反义转录RNA的表达调控研究

发布时间：2022-12-07 18:06

　　天然反义转录RNA是近年来在各物种中发现的新类型的内源性RNA。顺式天然反义转录RNA（cis-natural antisense transcripts,cis-NATs）因其从基因的互补DNA链转录而来,对其正义转录基因的调控存在时间和空间上的优势而得到了广泛的关注和研究。然而cis-NATs的生物学功能很大程度上是未知的。作为猪体内最大的组织骨骼肌占猪体重的40%-50%左右,因此在养猪生产中骨骼肌的生长发育直接决定了生猪产业的生产效益。研究猪骨骼肌生长发育基因表达调控机理一直以来都是育种工作的重点和热点之一。为了探索cis-NATs是否参与调控猪骨骼肌生长发育过程,该过程中的表达特征、调控功能以及其自身所受的表达调控机理,本研究系统地分析了中外猪种（长白猪和蓝塘猪）骨骼肌生长发育过程中cis-NATs及其特征,并利用公共数据挖掘了其潜在受到转录因子MYOD调控的证据。主要结果有:（1）cis-NATs广泛存在于猪骨骼肌生长发育过程中。通过系统分析长白和蓝塘猪背最长肌生长发育的10个时期链特异DGE（digital gene expression）RNA-seq数据。鉴定出356... 

【文章页数】：143 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
缩略语表
1 前言
    1.1 研究问题的由来
    1.2 文献综述
        1.2.1 NATs简述
        1.2.2 NATs调控基因表达机制研究进展
        1.2.3 cis-NATs是肌肉生长发育的重要调控因子
        1.2.4 猪骨骼肌生长发育过程
        1.2.5 猪cis-NATs研究进展
        1.2.7 转录因子调控cis-NATs表达研究进展
        1.2.6 转录因子MyoD对骨骼肌生长发育调控研究进展简述
        1.2.8 ChIP-seq及链特异RNA-seq简介
    1.3 本研究的目的意义
        1.3.1 主要目的
        1.3.2 本研究的意义
2 材料与方法
    2.1 技术路线
    2.2 实验材料
        2.2.1 NCBI数据库数据下载地址及序列号
        2.2.2 C2C12细胞系培养
        2.2.3 主要试剂
        2.2.4 实验仪器
        2.2.5 主要使用的软件、平台和数据库
    2.3 实验方法
        2.3.1 猪骨骼肌组织样品采集及总RNA提取
        2.3.2 组织总RNA反转录
        2.3.3 组织DNA提取
        2.3.4 细胞收集及总RNA提取
        2.3.5 细胞总RNA提取及完整性检测
        2.3.6 高通量测序
        2.3.7 PCR引物设计
        2.3.8 PCR反应条件及数据分析
    2.4 高通量数据分析
        2.4.1 测序数据质控
        2.4.2 测序数据比对及注释
        2.4.3 全基因组范围内鉴定SA基因
        2.4.4 全基因组范围内cis-NATs鉴定
        2.4.5 转录本表达量计算
        2.4.6 cis-NATs及其正义基因间相关表达分析
        2.4.7 cis-NATs及其正义基因剪接体间表达相关分析
        2.4.8 差异表达分析
        2.4.9 功能注释分析
        2.4.10 通路及测序数据可视化分析
        2.4.11 ChIP-seq数据结合峰分析及motif分析
        2.4.12 ChIP-seq数据结合峰注释
        2.4.13 ChIP-seq RNA-seq数据联合分析
3 结果
    3.1 细胞总RNA质控结果
        3.1.1 RNA完整性检测结果
        3.1.2 RNA浓度检测结果
    3.2 测序数据预处理
        3.2.1 测序数据质控
        3.2.2 测序数据比对结果
        3.2.3 比对结果注释
    3.3 猪全基因组范围内cis-NATs分析结果
        3.3.1 鉴定出3561个SA基因
        3.3.2 鉴定出3306个cis-NATs转录区域
    3.4 多手段验证猪cis-NATs
    3.5 猪cis-NATs表达模式分析及验证
        3.5.1 cis-NATs主要在胚胎期表达
        3.5.2 cis-NATs主要与其正义转录基因共表达
        3.5.3 cis-NATs影响其正义转录基因的可变剪切
        3.5.4 qPCR验证共表达关系
        3.5.5 超过1200个cis-NATs在肌肉发育过程中差异表达
        3.5.6 qPCR验证差异表达分析结果
    3.6 猪cis-NATs功能预测
        3.6.1 KEGG通路富集分析结果
        3.6.2 GeneOntology功能注释结果
        3.6.3 能量代谢通路可视化分析
    3.7 C2C12细胞系测序结果分析
        3.7.1 C2C12 RNA-seq数据分析
        3.7.2 MyoD ChIP-seq结合峰鉴定结果
        3.7.3 MyoD结合峰注释结果
        3.7.4 MyoD结合motif分析结果
    3.8 MyoD对cis-NATs表达调控初步分析
        3.8.1 C2C12 RNA-seq及ChIP-seq数据联合分析结果
    3.9 骨骼肌生长发育过程中MYOD对cis-NATs表达调控初步分析
4 讨论
    4.1 cis-NATs在骨骼肌生长发育中的作用
        4.1.1 cis-NATs广泛存在于猪骨骼肌生长发育过程中
        4.1.2 cis-NATs表达模式
        4.1.3 共表达正义反义转录基因对主要富集在能量代谢相关通路中
        4.1.4 共表达正义反义转录基因对与肌纤维类型
    4.2 骨骼肌细胞中Myo D在全基因组范围内广泛结合
    4.3 MYOD对反义转录基因的调控
        4.3.1 C2C12细胞系中cis-NATs潜在受到Myo D调控
        4.3.2 猪骨骼肌生长发育过程中cis-NATs与MYOD
5 小结
    5.1 本研究的主要结论
    5.2 本研究的创新点与特色
    5.3 本研究不足之处与下一步工作建议
在读期间的其他研究或实践工作
参考文献
附录
    附录A 补充数据
        附录A.1 NCBI参考基因组数据验证cis-NATs鉴定结果
        附录A.2 GeneOntology统计结果
        附录A.3 能量代谢相关通路可视化分析结果
    附录B 相关程序核心代码
        附录B.1 Reads注释perl语言脚本核心代码
        附录B.2 ChIP-seq注释perl语言核心代码
致谢
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]天然反义RNA（NATs）:基因表达的重要调控分子[J]. 毕延震,黄捷,姜黎.  中国生物化学与分子生物学报. 2010(09)



本文编号：3712594