BHD综合征因子FLCN调控氨基酸转运蛋白PAT1在细胞内定位的机制研究

发布时间：2023-02-12 09:09

　　BHD综合征(Birt-Hogg-Dubésyndrome)是由FLCN(folliculin)基因突变所引起的一种动物遗传疾病。现有证据表明FLCN蛋白参与了多种生物过程,包括信号转导、细胞粘附、溶酶体和线粒体的生物合成、细胞能量代谢和营养稳态等,但缺失FLCN导致BHD综合征的具体原因仍不清楚。通过对FLCN蛋白三维结构的研究发现其C末端具有一个DENN结构域,这一结果提示FLCN可能通过与某些Rab家族蛋白成员发生作用进而调控细胞内的囊泡运输过程。然而由于对被运输的货物分子尚缺乏了解,FLCN在囊泡运输中的具体功能还有待实验证实。质子协同氨基酸转运蛋白1(proton-assisted amino acid transporter 1,PAT1,又称SLC36A1)是一个在哺乳动物体内广泛分布的跨膜氨基酸转运蛋白。在多种类型的细胞里,PAT1主要定位在溶酶体表面,PAT1还可以定位在其它部位,包括细胞膜、伪足,神经细胞的轴突和突触小泡等。在大鼠平滑肌细胞,PAT1甚至定位在细胞核。这些结果说明PAT1的定位受多种机制调控,PAT1在不同细胞里执行的生理功能与其定位有关。本研究组的...

【文章页数】：123 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 FLCN研究进展
        1.1.1 FLCN的结构
        1.1.2 FLCN的功能
        1.1.3 FLCN在mTORC1信号通路中的作用
        1.1.4 FLCN在囊泡运输中的潜在功能
    1.2 氨基酸转运蛋白PAT1研究进展
        1.2.1 PAT1的结构
        1.2.2 PAT1在细胞内的定位
        1.2.3 PAT1在mTORC1信号通路中的作用
    1.3 Rab蛋白与囊泡运输
        1.3.1 Rab蛋白家族
        1.3.2 Rab蛋白活性的调控
        1.3.3 Rab蛋白在囊泡运输中的功能
    1.4 Rab11研究进展
        1.4.1 Rab11蛋白家族
        1.4.2 Rab11活性调节蛋白
        1.4.3 Rab11的效应因子
        1.4.4 Rab11在囊泡运输中的功能
    1.5 前期研究发现及本研究设想
        1.5.1 前期研究发现
        1.5.2 本研究设想
第二章 PAT1在HEK293细胞内的定位及运输途径
    2.1 材料
        2.1.1 细胞、载体和抗体
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 构建真核表达载体
        2.2.2 稳定表达PAT1-3×FLAG细胞株的构建
        2.2.3 细胞免疫荧光染色检测myc-PAT1的表达定位
    2.3 结果与分析
        2.3.1 重组质粒的酶切鉴定
        2.3.2 稳定表达PAT1-3×FLAG细胞株的Westernblot鉴定
        2.3.3 myc-PAT1与mCherry融合的不同囊泡标记蛋白的共定位
        2.3.4 myc-PAT1与内源囊泡标记蛋白的共定位
        2.3.5 myc-PAT1与TGN38、M6PR、EEA1以及Chmp5蛋白的共定位
        2.3.6 PAT1-3×FLAG的间接运输途径
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 FLCN对PAT1在细胞内分布的影响
    3.1 材料
        3.1.1 细胞、载体和抗体
        3.1.2 siRNA序列
        3.1.3 主要试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 FLCN对PAT1溶酶体定位的影响
        3.2.2 FLCN对PAT1细胞膜定位的影响
        3.2.3 细胞免疫荧光检测FLCN对PAT1胞内定位的影响
        3.2.4 FLCN对PAT1调控mTORC1活性的影响
        3.2.5 荧光定量PCR检测PAT1siRNA的干扰效率
    3.3 结果与分析
        3.3.1 抑制FLCN对PAT1-3×FLAG溶酶体定位的影响
        3.3.2 抑制FLCN对PAT1-3×FLAG细胞膜定位的影响
        3.3.3 细胞免疫荧光检测FLCN对PAT1细胞内定位的影响
        3.3.4 敲除FLCN对PAT1-3×FLAG溶酶体定位的影响
        3.3.5 敲除FLCN对PAT1-3×FLAG细胞膜定位的影响
        3.3.6 FLCN在PAT1过表达条件下对mTORC1的影响
        3.3.7 FLCN在抑制PAT1条件下对mTORC1的影响
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 FLCN与Rab11A存在蛋白与蛋白间相互作用
    4.1 材料
        4.1.1 细胞、载体和抗体
        4.1.2 主要试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 FLCN(1-340 AA)和FLCN(341-579 AA)重组质粒的构建
        4.2.2 FLCN与Rab5A,Rab7A以及Rab11A的共定位
        4.2.3 蛋白免疫共沉淀(co-IP)
    4.3 结果与分析
        4.3.1 FLCN重组质粒的酶切鉴定结果
        4.3.2 FLCN与GFP-Rab5A,GFP-Rab7A以及GFP-Rab11A的共定位分析以及GFP-Rab11A的共定位分析
        4.3.3 FLCN与Rab5A, Rab7A以及Rab11A的co-IP结果
        4.3.4 mFLCN与鼠源Rab5A,Rab7A以及Rab11A的co-IP结果
        4.3.5 FLCN通过DENN结构域与GFP-Rab11A结合
        4.3.6 FLCN可以结合GFP-Rab11B
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章Rab11A调控PAT1在溶酶体和细胞膜上的定位
    5.1 材料
        5.1.1 细胞、载体和抗体
        5.1.2 Rab11A干扰慢病毒
        5.1.3 主要试剂
    5.2 实验方法
        5.2.1 Rab11A-CA和Rab11A-DN过表达载体的构建
        5.2.2 抑制Rab11A表达对PAT1溶酶体和细胞膜定位的影响
        5.2.3 过表达Rab11A-DN突变体对PAT1溶酶体和细胞膜定位的影响
        5.2.4 细胞免疫荧光检测Rab11A对PAT1胞内定位的影响
        5.2.5 抑制Rab11A对PAT1蛋白稳定性的影响
        5.2.6 Rab11A对PAT1调控mTORC1活性的影响
    5.3 结果与分析
        5.3.1 Rab11A-CA和Rab11A-DN重组质粒的酶切鉴定结果
        5.3.2 抑制Rab11A表达促进PAT1在溶酶体上定位
        5.3.3 抑制Rab11A表达抑制PAT1在细胞膜定位
        5.3.4 过表达Rab11A-DN(S25N)突变体对PAT1溶酶体定位的影响
        5.3.5 过表达Rab11A-DN(S25N)突变体对PAT1细胞膜定位的影响
        5.3.6 细胞免疫荧光检测Rab11A对PAT1细胞内定位的影响
        5.3.7 抑制Rab11A促进PAT1被溶酶体降解
        5.3.8 Rab11A拮抗PAT1抑制mTORC1的作用
    5.4 讨论
    5.5 小结
第六章FLCN在Rab11A介导的囊泡运输中的功能研究
    6.1 材料
        6.1.1 细胞、载体和纯化蛋白
        6.1.2 抗体和试剂
    6.2 实验方法
        6.2.1 GEF活性检测实验
        6.2.2 Co-IP实验检测FLCN与不同形式Rab11A的结合特异性
        6.2.3 Co-IP实验检测PAT1与Rab5A,Rab7A,Rab11A的结合情况
        6.2.4 Co-IP实验检测FLCN敲除对PAT1-Rab11A相互作用的影响
        6.2.5 Co-IP实验检测FLCN敲除对Tf R-Rab11A相互作用的影响
    6.3 结果与分析
        6.3.1 FLCN与Rab11A的活性形式结合较为紧密
        6.3.2 PAT1-3×FLAG可以结合Rab5A、Rab7A和Rab11A
        6.3.3 FLCN特异地影响PAT1与Rab11A的结合
        6.3.4 FLCN促进Rab11A与TfR结合
    6.4 讨论
    6.5 小结
第七章 结论
创新点
下一步研究计划
附录
缩略词
参考文献
致谢
个人简历



本文编号：3740805