鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究

发布时间：2023-03-19 06:38

　　鸡球虫病是危害养鸡业最为严重的寄生虫病之一,每年给养鸡业带来巨大的经济损失。耐药虫株的出现、药物残留、鸡球虫活疫苗生产成本昂贵、散毒等问题,使鸡球虫病的防控面临更严峻的挑战。随着现代生物技术的发展,安全无毒的第三代疫苗被认为是理想的抗球虫疫苗;而筛选鉴定免疫原性强的保护性抗原和种特异性抗原是研发第三代疫苗的基础和关键。本研究应用比较免疫蛋白质组学对E.tenella特异性抗原组进行筛选鉴定;通过免疫原性试验鉴定E.tenella特异性抗原,并对其功能进行研究;为鸡球虫新型亚单位疫苗的研发提供理论依据和新思路。研究内容具体包括以下六个方面:1、E.tenella和E.maxima高免血清的制备和鉴定本研究通过口服感染鸡球虫卵囊制备E.tenella和E.maxima高免血清,应用ELISA、Western blot、体外阻断及被动免疫等试验对抗体质量进行评价。ELISA结果显示,随着接种次数的增多,血清抗体滴度升高,且第五次接种8天后血清抗体滴度达到高峰。以制备的高免血清为一抗对裂殖子全蛋白进行Western blot分析,结果显示,E.tenella免疫血清识别的抗原种类和反应强度均高...

【文章页数】：149 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 鸡球虫病概述
        1.1.1 病原生物学
        1.1.2 鸡球虫生活史
        1.1.3 鸡球虫病流行病学及危害
    1.2 鸡球虫免疫研究进展
        1.2.1 鸡球虫抗原的种类
        1.2.2 天然免疫反应
        1.2.3 细胞免疫
        1.2.4 体液免疫
    1.3 鸡球虫病防控研究进展
        1.3.1 鸡球虫病的药物防控
        1.3.2 鸡球虫病的疫苗防控
    1.4 蛋白质组学在球虫疫苗研发中的应用
        1.4.1 蛋白质组学概述
        1.4.2 蛋白质组学技术
        1.4.3 免疫蛋白质组学
        1.4.4 蛋白质组学在鸡球虫抗原鉴定中的应用
    1.5 本研究的意义
2 材料方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 试验质粒、菌株、虫体、细胞
        2.1.2 试验动物
        2.1.3 主要试剂与药品
        2.1.4 主要仪器、设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 高免血清的制备
        2.2.2 子孢子的分离纯化
        2.2.3 裂殖子的分离纯化
        2.2.4 裂殖子蛋白质的抽提
        2.2.5 免疫差异蛋白质双向电泳
        2.2.6 RNA的提取
        2.2.7 反转录合成c DNA
        2.2.8 荧光定量PCR
        2.2.9 基因PCR扩增及产物回收
        2.2.10 大肠杆菌感受态的制备
        2.2.11 Blunt载体的制备
        2.2.12 重组质粒的构建
        2.2.13 原核表达
        2.2.14 SDS-PAGE分析
        2.2.15 His重组蛋白的纯化
        2.2.16 鼠源多克隆抗体的制备
        2.2.17 组织蛋白抽提
        2.2.18 Western blot实验
        2.2.19 酵母表面展示
        2.2.20 间接免疫荧光实验
        2.2.21 多抗抑制子孢子入侵实验
        2.2.22 酶联免疫吸附试验(ELISA)
        2.2.23 抗球虫指数ACI计算
        2.2.24 细胞转染
        2.2.25 免疫共沉淀
        2.2.26 数据分析
3 结果
    3.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备与鉴定
        3.1.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备
        3.1.2 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体外鉴定
        3.1.3 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体内鉴定
    3.2 柔嫩艾美尔球虫差异蛋白质组的筛选、鉴定
        3.2.1 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白双向电泳分析
        3.2.2 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白免疫蛋白质组学分析结果
        3.2.3 柔嫩艾美尔球虫免疫差异基因的鉴定
        3.2.4 柔嫩艾美尔球虫免疫差异蛋白质表达、纯化
        3.2.5 免疫蛋白质组学可靠性检测
    3.3 差异抗原功能初步分析
        3.3.1 差异抗原多克隆抗体的制备
        3.3.2 差异抗原不同发育阶段转录谱分析
        3.3.3 差异抗原在不同阶段的表达和定位分析
        3.3.4差异抗原多克隆抗体体外抑制子孢子入侵实验
    3.4 柔嫩艾美尔球虫特异性抗原的鉴定
        3.4.1 巨型艾美尔球虫同源基因的克隆、表达
        3.4.2 重组抗原免疫保护力评价
        3.4.3 重组抗原诱导体液免疫的能力
    3.5 特异性抗原CCT2 的功能研究
        3.5.1 EmCCT2 多抗的制备
        3.5.2 CCT2 多抗对子孢子入侵的抑制作用
        3.5.3 EtCCT2 与宿主细胞的相互作用
        3.5.4 EtCCT2 对宿主细胞的影响
        3.5.5 EmCCT2与EtCCT2 的功能差异
        3.5.6 EtCCT2对GgCCT4 表达的影响
        3.5.7 柔嫩艾美尔球虫感染对宿主CCT4 表达的影响
    3.6 特异性抗原EtMIC1 表位及其关键氨基酸序列的鉴定
        3.6.1 表位的鉴定
        3.6.2 表位关键氨基酸的鉴定
        3.6.3 不同种艾美尔球虫表位种特异性鉴定
        3.6.4 感染初期EtMIC1 亚细胞定位结果
        3.6.5 EtMIC1 表位及结构域免疫保护力评价
        3.6.6 EtMIC1 表位诱导体液免疫和细胞免疫的能力
4 讨论
    4.1 免疫蛋白质组学具有筛选高效抗原的优势
    4.2 EtCCT2 可能是柔嫩艾美尔球虫表面抗原
    4.3 柔嫩艾美尔球虫Profilin样蛋白是潜在候选抗原
    4.4 柔嫩艾美尔球虫CCT2 可能是毒力因子
    4.5 ⁹¹LITFATRSK⁹⁹是EtMIC1 的关键抗原表位
5 结论
6 参考文献
7 致谢
8 博士在读期间发表的论文



本文编号：3764762