水稻干尖线虫脂肪酸和维生素A结合蛋白基因的克隆和功能研究

发布时间：2023-03-23 02:51

　　水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)是一种迁移性植物地上部寄生线虫、危害多种植物。脂肪酸和维生素A结合蛋白(Fatty acid-and retinol-binding proteins,FAR)是线虫特有蛋白,在线虫营养吸收、调控寄主的组织以及抑制寄主的防卫反应方面具有重要的作用,因此是一种具有应用前景的防治寄生线虫的靶标,近些年受到广泛关注。基因沉默(RNAi)是一种研究植物寄生线虫基因功能的强大工具,在植物寄生线虫RNAi研究中,目前普遍采用浸泡和植物介导的方法,但是两者均存在一些问题,制约其在植物寄生线虫基因功能研究中的应用。因此,根据不同类型植物寄生线虫的生物学特性,研究建立更合理、更简便和更有效的RNAi方法是十分必要的。本研究利用实验室已有的水稻干尖线虫2个种群的转录组数据库,分析和筛选得到与脂肪酸和维生素A结合蛋白基因相似的转录本序列。利用RACE技术,鉴定和扩增了水稻干尖线虫的7个新Ab-far基因,利用生物信息学方法对7个Ab-far基因的结构和特征进行分析;对这些基因进行原核表达,应用荧光光谱测定法对对纯化后的蛋白进行配体结合实验;运用qP...

【文章页数】：153 页

【学位级别】：博士

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摘要
abstract
缩写词及英汉对照
第1章 前言
    1.1 研究背景
        1.1.1 水稻干尖线虫的分类地位及形态特征
        1.1.2 水稻干尖线虫的生物学特性
        1.1.3 水稻干尖线虫的分布及其寄主
        1.1.4 水稻干尖线虫的发生和危害
        1.1.5 水稻干尖线虫的防治
        1.1.6 植物寄生线虫的效应子
        1.1.7 线虫脂肪酸和维生素A结合蛋白的研究现状
        1.1.8 植物线虫功能基因研究的方法和技术
    1.2 研究目的和意义
        1.2.1 水稻干尖线虫脂肪酸和维生素A结合蛋白家族基因的克隆和功能分析
        1.2.2 真菌介导的RNAi方法构建及研究Ab-far基因防治水稻干尖线虫的机制
第2章 水稻干尖线虫FAR蛋白家族基因的克隆和结构分析
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 材料
            2.2.1.1 供试线虫
            2.2.1.2 供试植物材料、菌种和质粒载体
            2.2.1.3 主要试剂及配制
            2.2.1.4 常用仪器设备
        2.2.2 方法
            2.2.2.1 水稻干尖线虫的培养繁殖
            2.2.2.2 水稻干尖线虫RNA的提取
            2.2.2.3 水稻干尖线虫DNA的微量提取
            2.2.2.4 3’RACE和5’RACEcDNA合成
            2.2.2.5 cDNA的合成
            2.2.2.6 水稻干尖线虫FAR蛋白家族基因cDNA和基因组DNA全长克隆
            2.2.2.7 PCR产物纯化回收
            2.2.2.8 PCR产物克隆及测序
            2.2.2.9 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取
            2.2.2.10 序列生物信息学分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 水稻干尖线虫FAR蛋白家族基因的克隆及其分析
        2.3.2 水稻干尖线虫FAR蛋白家族基因cDNA全长扩增及其序列分析
        2.3.3 水稻干尖线虫FAR蛋白家族基因编码的氨基酸序列分析
            2.3.3.1 水稻干尖线虫FAR蛋白家族基因编码的氨基酸序列特征
            2.3.3.2 水稻干尖线虫FAR蛋白的三维结构分析
            2.3.3.3 水稻干尖线虫FAR蛋白的亚细胞定位
            2.3.3.4 水稻干尖线虫FAR蛋白的跨膜区预测
            2.3.3.5 水稻干尖线虫FAR蛋白的疏水/亲水性分析
            2.3.3.6 水稻干尖线虫FAR蛋白的磷酸化位点预测
            2.3.3.7 水稻干尖线虫FAR蛋白的糖基化位点预测
            2.3.3.8 水稻干尖线虫FAR蛋白的信号肽预测
            2.3.3.9 水稻干尖线虫FAR蛋白的同源性分析
        2.3.4 水稻干尖线虫FAR蛋白家族基因编码区扩增
    2.4 小结
第3章 水稻干尖线虫FAR蛋白家族基因的表达模式和功能分析
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 材料
            3.2.1.1 供试线虫
            3.2.1.2 供试植物材料、菌种和质粒载体
            3.2.1.3 主要试剂及配制
            3.2.1.4 常用仪器设备
        3.2.2 方法
            3.2.2.1 水稻干尖线虫的培养繁殖
            3.2.2.2 水稻干尖线虫Ab-far-2^Ab-far-8基因的原核表达
            3.2.2.3 荧光光谱法检测四种FAR蛋白的配体结合实验
            3.2.2.4 水稻干尖线虫Ab-far-2^Ab-far-8基因的Southern杂交
            3.2.2.5 水稻干尖线虫Ab-far-2^Ab-far-8基因的原位杂交
            3.2.2.6 水稻干尖线虫Ab-far-2^Ab-far-8基因的表达量分析
            3.2.2.7 水稻干尖线虫Ab-far-2和Ab-far-4基因的体外RNAi分析
            3.2.2.8 数据分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 水稻干尖线虫FAR蛋白的表达和功能分析
            3.3.1.1 水稻干尖线虫Ab-FAR-2^Ab-FAR-8的原核表达及蛋白纯化结果
            3.3.1.2 水稻干尖线虫FAR蛋白配合基和配体结合实验
        3.3.2 水稻干尖线虫FAR蛋白家族基因Southern杂交
        3.3.3 水稻干尖线虫FAR蛋白家族基因的原位杂交
        3.3.4 水稻干尖线虫FAR蛋白家族基因的表达量分析
        3.3.5 水稻干尖线虫Ab-far-2和Ab-far-4基因的体外RNAi分析
            3.3.5.1 Ab-far-2和Ab-far-4基因的沉默效率
            3.3.5.2 Ab-far-2和Ab-far-4基因沉默对水稻干尖线虫繁殖的影响
    3.4 小结
第4章 灰葡萄孢菌介导的Ab-farRNAi研究
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 材料
            4.2.1.1 供试线虫
            4.2.1.2 供试植物材料、菌种和质粒载体
            4.2.1.3 主要试剂及配制
            4.2.1.4 常用仪器设备
        4.2.2 方法
            4.2.2.1 水稻干尖线虫和灰葡萄孢菌的培养
            4.2.2.2 水稻干尖线虫Ab-far-1RNAi真菌表达载体的构建
            4.2.2.3 Ab-far-1RNAi真菌表达载体分别转化农杆菌
            4.2.2.4 农杆菌介导转化灰葡萄孢菌
            4.2.2.5 转基因真菌的分子鉴定
            4.2.2.6 潮霉素和空载体对灰葡萄孢菌生长和水稻干尖线虫繁殖量的影响
            4.2.2.7 Ab-far-1基因沉默后水稻干尖线虫的形态测量值
            4.2.2.8 水稻干尖线虫在转基因灰葡萄孢菌上的繁殖力及其Ab-far-1基因表达量
            4.2.2.9 水稻干尖线虫取食转基因真菌后对拟南芥的致病性
            4.2.2.10 取食转基因真菌的水稻干尖线虫在拟南芥上寄生繁殖后代的目的基因表达量检测
            4.2.2.11 数据分析
    4.3 结果与分析
        4.3.1 转Ab-far-1dsRNA真菌的产生和分析
            4.3.1.1 空载体pBS质粒的构建
            4.3.1.2 真菌表达载体pBS2-Ab-far-1的构建
            4.3.1.3 真菌表达对照载体pBS-eGFP2的构建
            4.3.1.4 Ab-far-1dsRNA表达载体转化农杆菌
            4.3.1.5 转Ab-far-1dsRNA真菌的获得及分子检测
        4.3.2 潮霉素和空载体对转基因真菌和水稻干尖线虫生长和繁殖情况的影响
        4.3.3 水稻干尖线虫取食转Ab-far-1dsRNA灰葡萄孢菌后形态表型变化
        4.3.4 水稻干尖线虫取食转Ab-far-1dsRNA灰葡萄孢菌后的繁殖量和Ab-far-1表达量
        4.3.5 灰葡萄菌介导的Ab-far-1沉默对水稻干尖线虫致病力影响及其沉默效应的持效性和可遗传性
    4.4 小结
第5章 全文讨论与结论
    5.1 水稻干尖线虫FAR蛋白家族基因的克隆和结构
    5.2 水稻干尖线虫FAR蛋白家族基因的表达模式和功能的多样性
    5.3 灰葡萄孢菌介导的Ab-farRNAi
    5.4 本研究的创新性
    5.5 研究展望
致谢
参考文献
附录A 主要试剂及配制
附录B 常用仪器设备
附录C 水稻干尖线虫8个Ab-far基因的转录本序列、cDNA和DNA全长序列
附录D 本研究所使用的引物
附录E 博士在读期间参与发表论文和申请专利



本文编号：3768130