坦布苏病毒对宿主单核/巨噬细胞嗜性及其感染机制的初步探索

发布时间：2023-04-09 14:31

　　坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)是近年来出现在我国的一种新发传染病病原,属于黄病毒科、黄病毒属成员,具有传播迅速,宿主范围广泛,跨种间传播等特点。TMUV是目前已知唯一对鸭致病的黄病毒,感染成鸭后主要侵害生殖系统,引发产蛋量的急剧下降,是威胁我国养鸭业的重要病原。宿主免疫细胞是黄病毒属病毒的重要靶细胞,两者间存在着广泛的相互作用。然而,目前的研究主要集中在登革热病毒和寨卡病毒等病原,对TMUV与宿主免疫细胞间的互作却鲜有报道。为探索TMUV感染过程中不同免疫细胞对其增殖能力的影响,本研究分别利用细胞差数分选法和流式细胞仪分选法纯化富集外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中不同细胞亚群,并检测在体内和体外条件下TMUV对PBMC各亚群细胞的感染情况,发现TMUV对PBMC中的单核吞噬细胞系统(Mononuclear phagocytic system,MPS)具有显著的偏嗜性。本研究进一步利用单核巨噬细胞体内清除剂Clodronate lipsomes清除SPF鸡/鸭MPS,发现清除MPS能够显著降低无特定病...

【文章页数】：82 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 坦布苏病毒
        1.1.1 坦布苏病毒的病原学研究进展
        1.1.2 TMUV的流行病学研究进展
        1.1.3 TMUV的诊断与预防研究进展
    1.2 单核吞噬细胞系统(MPS)与病毒相互作用研究进展
        1.2.1 MPS在病毒增殖中的作用
        1.2.2 病毒感染对MPS功能的影响
    1.3 MPS的氧化还原系统
        1.3.1 呼吸爆发作用
        1.3.2 一氧化氮(NO)
        1.3.3 转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)
    1.4 本研究目的意义
第二章 TMUV对禽MPS偏嗜性的研究
    2.1 实验材料
        2.1.1 病毒株和细胞系
        2.1.2 实验动物
        2.1.3 主要试验试剂
        2.1.4 其他试剂及配置
        2.1.5 试验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 病毒扩繁及毒价测定
        2.2.2 SPF鸡/鸭外周血单个核细胞(PBMC)的分离
        2.2.3 差数分离法分离PBMC
        2.2.4 差数分离法分离MPS的纯度检测
        2.2.5 RT-qPCR检测TMUV增殖
        2.2.6 流式细胞仪分选PBMC
        2.2.7 动物感染实验
        2.2.8 数据统计分析
    2.3 实验结果
        2.3.1 TMUV体外感染SPF鸡 /鸭PBMC时对贴壁细胞具有偏嗜性
        2.3.2 差数贴壁法分离MPS纯度的检测
        2.3.3 TMUV体外感染SPF鸡PBMC时对MPS具有偏嗜性
        2.3.4 TMUV体内感染SPF鸡/鸭PBMC时对MPS/贴壁细胞具有偏嗜性
        2.3.5 清除SPF鸡体内MPS能够有效抑制TMUV的感染
        2.3.6 清除SPF鸭体内MPS能够有效抑制TMUV的感染
    2.4 讨论
第三章 TMUV感染HD11细胞系对IFN-Ⅰ信号通路的影响
    3.1 实验材料
        3.1.1 病毒株和细胞系
        3.1.2 主要试验试剂
        3.1.3 其他试剂及配置
        3.1.4 试验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 测定TMUV在HD11上的生长曲线
        3.2.2 Western blot检测TMUV在HD11中增殖情况
        3.2.3 RNA-seq样品制备
        3.2.4 高通量测序及数据分析
        3.2.5 ELISA检测细胞因子含量
        3.2.6 双荧光素酶报告系统检测IFN-β
        3.2.7 提取核糖体新生肽链复合物RNA(RNC-RNA)并利用RT-qPCR检测IFN-β表达量
        3.2.8 数据统计分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 TMUV在HD11上的增殖情况鉴定
        3.3.2 RNA-seq结果分析
        3.3.3 IFN-α/β抑制TMUV增 殖
        3.3.4 TMUV感染对IF N-α/β具有不同的影响
        3.3.5 TMUV感染不影响IFN-β的释放过程
        3.3.6 TMUV感染不影响IFN-β的翻译起始过程
        3.3.7 TMUV感染促进IFN-β的降解
        3.3.8 TMUV感染不影响部分禽源干扰素刺激基因(chISGs)的产生
    3.4 讨论
第四章 TMUV感染HD11细胞系后对呼吸爆发反应的影响
    4.1 实验材料
        4.1.1 病毒株、细菌株和细胞系
        4.1.2 主要试验试剂
        4.1.3 试验仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 RNA-seq样品制备及数据分析
        4.2.2 NO浓度检测
        4.2.3 超氧化物检测
        4.2.4 活性氧(ROS)检测
        4.2.5 细胞总SOD酶活性检测
        4.2.6 siRNA敲低Nrf2基因
        4.2.7 激光共聚焦试验(confocal)
        4.2.8 RT-qPCR检测Nrf2介导基因的表达
        4.2.9 测定S.pullorum在共感染条件下的增殖情况
        4.2.10 数据统计分析
    4.3 实验结果
        4.3.1 TMUV感染抑制活性氮(RNS)的产生
        4.3.2 TMUV感染HD11不刺激产生活性氧(ROS)和超氧化物
        4.3.3 TMUV感染抑制ROS和超氧化物的产生
        4.3.4 呼吸爆发作用抑制TMUV的增殖
        4.3.5 TMUV感染促进S.pullorum在HD11中的增殖
        4.3.6 TMUV感染调控NADPH氧化酶(NADPH oxidase)各组分基因表达
        4.3.7 TMUV感染提高HD11细胞SOD酶活性
        4.3.8 TMUV感染促进Nrf2介导的抗氧化基因显著上升
        4.3.9 TMUV感染促进Nrf2蛋白入核
        4.3.10 siRNA敲低Nrf2基因的表达显著拮抗TMUV对呼吸爆发作用的抑制作用
        4.3.11 siRNA敲低Nrf2基因的表达拮抗TMUV对SOD酶活性的促进作用
        4.3.12 siRNA敲低Nrf2基因的表达拮抗TMUV对抗氧化基因的激活作用
        4.3.13 siRNA敲低Nrf2基因的表达抑制TMUV的增殖
    4.4 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3787179