贝壳再生过程中Shematrin-2的功能及其转录调控的研究

发布时间：2023-05-11 05:55

　　软体动物壳是一种迷人的生物矿物质,它由高度有序的碳酸钙复合物组成。研究表明,它的贝壳在损坏后可以进行修复再生。该修复过程与贝壳的生长过程类似,均受到生物大分子,尤其是贝壳基质蛋白(SMP)来调节。基质蛋白Shematrin-2,其表达水平在外套膜组织中最高,其含量在合浦珠母贝的贝壳中最高,已被认为是生物矿化的关键参与者,但对其功能及调节机制知之甚少。在本论文中,我们利用蛋白质组学的方法,鉴定了合浦珠母贝贝壳损伤5-20天修复再生的贝壳的SMPs,并比较了新生贝壳与成熟贝壳之间的微观结构差异。虽然新生的贝壳晶型是方解石,但与再生过程中新生贝壳的微观结构不同,这可以模拟胚胎幼贝发育过程中贝壳的形成过程。此外,我们从新生的贝壳中发现了49个SMPs,包括仅存在于成熟的珍珠层中的一些蛋白质。另一方面,新生贝壳的基质蛋白还能够在体外影响Ca CO₃晶体形貌,降低晶体的结晶度。这部分工作可以加深我们对贝壳形成过程的认识。此外,我们在体外表达并纯化了基质蛋白Shematrin-2,并探讨了其转录调控的功能和机制。体外功能实验表明,Shematrin-2可以结合贝壳的方解石、文石...

【文章页数】：125 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
主要英文缩略词对照表
第1章 前言
    1.1 问题的提出
    1.2 选题背景及意义
    1.3 文献综述
        1.3.1 生物矿化概述
        1.3.2 软体动物的贝壳结构
        1.3.3 软体动物的矿化系统
        1.3.4 贝壳的修复再生
        1.3.5 合浦珠母贝中基质蛋白的研究进展
        1.3.6 合浦珠母贝中基质蛋白转录调控的研究进展
    1.4 论文研究方法
    1.5 论文结构
第2章 实验材料与方法
    2.1 实验动物
    2.2 贝壳再生模型的构建
    2.3 贝壳基质蛋白的提取
    2.4 贝壳间液蛋白的提取
    2.5 蛋白浓度的测定
    2.6 蛋白的质谱(LC-MS/MS)
    2.7 Unigene注释和分类
    2.8 体外结晶实验
    2.9 蛋白与文石、方结石和几丁质的结合实验
    2.10 结晶速率实验
    2.11 ACC相转实验
    2.12 晶型鉴定与形貌观察
        2.12.1 Raman光谱分析
        2.12.2 X射线衍射(XRD)
        2.12.3 扫描电子显微镜观察(SEM)
        2.12.4 透射电子显微镜观察(TEM)
        2.12.5 原子力显微镜观察(AFM)
    2.13 RNA的提取
    2.14 转录因子cDNA全长的克隆
        2.14.1 RACE c DNA模板的准备
        2.14.2 转录因子的RACE引物
        2.14.3 转录因子的RACE
        2.14.4 目的片段回收、连接、转化及鉴定
        2.14.5 转录因子全长的鉴定
    2.15 序列分析
    2.16 组织分布及胚胎发育时期表达分布检测
        2.16.1 组织分布检测
        2.16.2 胚胎发育过程中基因的表达分布检测
    2.17 基因组DNA提取
    2.18 基质蛋白Shematrin-2 基因启动子的克隆
    2.19 细胞培养
    2.20 载体的构建
    2.21 细胞转染
    2.22 双荧光素酶活性的测定
        2.22.1 裂解细胞
        2.22.2 双荧光素酶报告基因系统的检测
    2.23 转录因子在细胞中的亚定位
    2.24 多克隆抗体的制备
        2.24.1 Shematrin-2 蛋白的获取及纯化
        2.24.2 Shematrin-2 多克隆抗体的获取及纯化
    2.25 Shematrin-2 抗体抑制实验
    2.26 Shematrin-2 的表达与纯化
    2.27 贝壳损伤修复
    2.28 RNA干扰实验
        2.28.1 dsRNA的合成和纯化
        2.28.2 dsRNA的注射及后期检测、观察
    2.29 数据处理与分析
第3章 贝壳损伤修复过程的探究
    3.1 合浦珠母贝贝壳的再生过程
    3.2 合浦珠母贝贝壳再生过程的微观结构
        3.2.1 SEM观察合浦珠母贝贝壳再生的过程
        3.2.2 TEM观察合浦珠母贝贝壳再生的过程
        3.2.3 AFM观察合浦珠母贝贝壳再生的过程
        3.2.4 合浦珠母贝贝壳再生过程的生长模型
    3.3 合浦珠母贝贝壳再生过程的有机框架结构
    3.4 新生贝壳的基质蛋白及其功能
        3.4.1 新生贝壳基质蛋白对碳酸钙晶貌的影响
        3.4.2 新生贝壳基质蛋白对碳酸钙晶型的影响
        3.4.3 新生贝壳基质蛋白的分析
    3.5 讨论
    3.6 小结
第4章 基质蛋白Shematrin-2 在生物矿化中的功能研究
    4.1 Shematrin-2 的分布、表达和纯化
    4.2 Shematrin-2 与文石、方解石和几丁质的结合特性
    4.3 Shematrin-2 在贝壳形成中的作用
    4.4 在贝壳损伤修复中Shematrin-2 基因的表达变化
    4.5 Shematrin-2对ACC向稳定晶型转变的影响
    4.6 Shematrin-2 对碳酸钙沉积速率的影响
    4.7 Shematrin-2 对碳酸钙结晶的影响
    4.8 讨论
    4.9 小结
第5章 Shematrin-2 基因的转录调控研究
    5.1 Shematrin-2 基因启动子的克隆及其转录活性的检测
    5.2 转录因子C/EBPs和 NF-Ys的克隆
    5.3 不同组织中Pf-C/EBPs和 Pf-NF-Ys的表达分布
    5.4 不同胚胎幼体发育时期Pf-C/EBPs和 Pf-NF-Ys的表达分布
    5.5 Pf-C/EBP-A和 Pf-C/EBP-B在 HEK-293T细胞中的定位
    5.6 Pf-C/EBP-A和 Pf-C/EBP-B对 Shematrin-2 基因的转录调控
    5.7 Pf-C/EBP-A和 Pf-C/EBP-B对 Shematrin-2 的体内调控作用
    5.8 讨论
    5.9 小结
第6章 总结与展望
    6.1 论文总结
    6.2 论文展望
        6.2.1 贝壳再生过程中分子机理的探究
        6.2.2 贝壳形成模型的进一步探究
        6.2.3 对贝壳转录调控机理的探讨
参考文献
致谢
声明
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果



本文编号：3814298