猪β防御素114的表达调控机制及其在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用研究

发布时间：2023-12-09 08:01

　　防御素是哺乳动物先天免疫的重要组成部分,近些年的研究发现防御素具有抗菌活性、促炎抗炎、适应性免疫等多种生物学功能,既具有开发成抗生素替代品的潜力,又可以作为提高抗病力的药物靶点。2012年通过对猪的基因组比对分析发现了猪βdefensin 114(PBD114),目前为止PBD114的表达调控机制,生物学功能及其机制尚未有报道。因此本研究开展五个试验,首先克隆并分析了PBD114基因序列,比较了不同品种猪PBD114基因表达的差异,探索了PBD114的表达调控机制;在此基础上,成功表达出PBD114蛋白,并以小鼠和IPEC-J2细胞为模型,研究了PBD114在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用和机制。主要研究结果如下:试验一PBD114基因的克隆、序列分析及其在不同品种猪间的差异表达藏猪是西藏和川西地区特有的猪种之一,与外种猪相比,具有耐粗饲和抗病力强的优点。本试验分别以藏猪和DLY猪的cDNA为模板,克隆了藏猪和DLY猪PBD114基因CDS序列,用DNAMAN比对分析,且分析了猪、人、大猩猩和瘤牛的βdefensin114的氨基酸序列。结果表明:藏猪和DLY猪的PBD114基因CDS区序...

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【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
本文缩略语表(Abbreviations)
前言
第一章 文献综述
    1 防御素概述
        1.1 防御素的种类
        1.2 防御素的分布与表达
    2 防御素的表达调控
        2.1 营养素对猪防御素的表达调控
        2.2 非营养素对猪防御素的表达调控
    3 防御素的生物学功能
        3.1 抗菌活性
        3.2 促炎和抗炎
        3.3 屏障保护作用
        3.4 加强趋化作用
        3.5 Defensins和 TLRs
        3.6 增强胞内外杀伤能力
        3.7 促进细胞分化
    4 Defensins的应用中遇到的问题
    5 存在的问题
第二章 本研究的目的、意义、主要内容和技术路线
    1 研究的目的和意义
    2 研究内容
    3 技术路线
第三章 试验研究
    试验一 PBD114 基因的克隆、序列分析及其在不同品种猪间的差异表达
        一、Beta defensin114 的序列分析
            1 PBD114 克隆技术图
            2 试验材料
            3 试验方法
                3.1 总RNA提取和反转录
                3.2 PBD114 基因的扩增
                3.3 核酸电泳
                3.4 DNA纯化
                3.5 DNA加 A
                3.6 DNA连接
                3.7 大肠杆菌感受态制备
                3.8 转化与初筛
                3.9 测序与分析
            4 试验结果
                4.1 PBD114 的克隆及其序列分析
                4.2 不同物种beta defensin114 同源性
            5 讨论
            6 小结
        二、不同品种猪PBD114 基因的差异表达
            1 材料与方法
                1.1 试验设计
                1.2 组织样品采集
                1.3 测定指标与方法
                    1.3.1 总RNA提取及反转录
                    1.3.2 引物设计
                    1.3.3 qRT-PCR
                1.4 数据处理与统计分析
            2 试验结果
                2.1 PBD114 在藏猪和DLY猪组织中的表达丰度
                2.2 PBD114 在藏猪和DLY猪中的差异表达
            3 讨论
            4 小结
    试验二 PBD114 基因的表达调控机制研究
        1 材料与方法
            1.1 试验材料
            1.2 试验设计
                1.2.1 E.Coli K88 攻毒对PBD114 基因表达的影响
                1.2.2 不同TLRs信号途径对PBD114 基因表达的影响
                1.2.3 转录因子RELA、FOS和 JUN对 PBD114 基因表达的调控
                1.2.4 转录因子RELA和 FOS的抑制对IPEC-J2的PBD114 基因表达的影响
            1.3 试验方法
                1.3.1 腹泻评分
                1.3.2 E.coli K88 的培养
                1.3.3 细胞培养
                1.3.4 总RNA提取、反转录和qRT-PCR
                1.3.5 酶联免疫检测细胞因子
                1.3.6 PBD114 启动子区转录因子结合预测
                1.3.7 载体构建
                1.3.8 转染与荧光检测
            1.4 数据处理与统计分析
        2 试验结果
            2.1 免疫激活对PBD114 基因表达的影响
            2.2 不同TLRs信号途径对PBD114 基因表达的调控
            2.3 转录因子RELA、FOS和 JUN对 PBD114 基因表达的调控
            2.4 反向验证转录因子RELA和 FOS对 PBD114 表达的调控
        3 讨论
        4 小结
    试验三 PBD114 的大肠杆菌异源表达及其生物学特性研究
        1 表达策略
        2 试验材料
        3 试验方法
            3.1 表达载体的构建
            3.2 重组大肠杆菌构建
            3.3 诱导表达
            3.4 SDS-PAGE鉴定
            3.5 蛋白质质谱
            3.6 诱导表达条件优化
                3.6.1 诱导初始OD值的优化
                3.6.2 诱导剂IPTG的优化
                3.6.3 诱导时间的优化
            3.7 重组蛋白的纯化回收
            3.8 PBD114 蛋白质的空间结构和物理化学特性的预测
            3.9 MIC
            3.10 溶血性
            3.11 细胞毒性
        4 数据处理与统计分析
        5 试验结果
            5.1 表达载体的构建
            5.2 重组菌Origami B-pET32-PBD114 的构建
            5.3 重组蛋白rPBD114 的表达
            5.4 表达条件的优化
            5.5 重组蛋白rPBD114 的纯化和蛋白质质谱鉴定
            5.6 重组蛋白rPBD114 的空间结构和物理化学特性
            5.7 最小抑菌浓度
            5.8 溶血性
            5.9 细胞毒性
        6 讨论
        7 小结
    试验四 重组PBD114 对肠道屏障炎性损伤的缓解及其机制
        1 材料与方法
            1.1 试验材料
            1.2 试验设计
                1.2.1 重组蛋白rPBD114 处理IPEC-J2 浓度梯度
                1.2.2 重组蛋白rPBD114 处理IPEC-J2 时间梯度
                1.2.3 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 肠道屏障炎性损伤
                1.2.4 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 肠道屏障炎性损伤及其机制
            1.3 试验方法
                1.3.1 细胞培养
                1.3.2 抑制剂安全剂量
                1.3.3 细胞增殖
                1.3.4 荧光定量PCR
                1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡
                1.3.6 ELISA检测细胞因子
                1.3.7 免疫荧光检测ZO-1和claudin-1
                1.3.8 免疫印迹
            1.4 数据处理与统计分析
        2 试验结果
            2.1 重组蛋白rPBD114 浓度梯度和时间梯度的优化
                2.1.1 重组蛋白rPBD114 浓度梯度优化
                2.1.2 重组蛋白rPBD114 时间梯度优化
            2.2 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 炎性损伤
                2.2.1 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞增殖的影响
                2.2.2 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞凋亡的影响
                2.2.3 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞凋亡基因的影响
                2.2.4 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞炎症因子的影响
                2.2.5 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞紧密连接蛋白的影响
            2.3 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 肠道屏障炎性损伤及其机制
                2.3.1 抑制剂浓度梯度筛选
                2.3.2 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞增殖的影响
                2.3.3 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞紧密连接蛋白的影响
                2.3.4 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞炎症因子的影响
                2.3.5 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞凋亡的影响
                2.3.6 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞凋亡基因和凋亡蛋白的影响
                2.3.7 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞NF-κB/MAPK信号通路蛋白的影响
        3 讨论
        4 小结
    试验五 重组蛋白rPBD114 对小鼠肠道屏障炎性损伤的缓解作用
        1 材料与方法
            1.1 试验材料
            1.2 试验设计
            1.3 饲养管理
            1.4 样品采集
            1.5 测定指标与方法
                1.5.1 生长性能
                1.5.2 血液生化
                1.5.3 空肠粘膜凋亡
                1.5.4 肠道形态
                1.5.5 空肠免疫荧光
                1.5.6 荧光定量PCR
            1.6 数据处理与统计分析
        2 试验结果
            2.1 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠生长性能的影响
            2.2 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠脏器指数的影响
            2.3 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠血清二胺氧化酶和D-乳酸的影响
            2.4 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠血清生化的影响
            2.5 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠血清免疫球蛋白和补体的影响
            2.6 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠肠道形态的影响
            2.7 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠空肠紧密连接蛋白的影响
            2.8 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠空肠凋亡及相关基因的影响
            2.9 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠炎症的影响
        3 讨论
        4 小结
第四章 总体讨论、结论与展望
    1 总体讨论
    2 主要结论
    3 创新点
    4 展望
参考文献
附录
致谢
作者简介



本文编号：3871166