桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析
发布时间：2023-12-09 08:59
桑树(Morus alba)根系发达,枝繁叶茂,生命力旺盛,具有较强的环境适应性,因此在世界范围内分布广泛。在我国,桑树作为生态防护林选用树种,可起到防沙固土,减少地表径流,保持原生态土壤结构的作用。另一方面,因桑树生长迅速,地上部分生物量大,被应用到自然生态修复系统中,例如修复被重金属污染的土壤、多石的贫瘠荒漠以及戈壁沙漠化区域等。桑树具有顽强的生存能力,源于其所拥有的独特生理特性,近年来在植物遗传学应用领域备受关注,涉及桑树抗逆基因资源挖掘及开发利用等研究。本研究从桑树中克隆得到3个干旱差异表达基因:叶绿体干旱胁迫诱导蛋白编码基因(chloroplast drought-induced stress protein of 32 k Da,Ma CDSP32),IAA-氨基酸水解酶编码基因(ILR1-5(IAA-amino acid hydrolase ILR1-like 5,Ma ILR1)和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,Ma APX2))进行基因克隆、表达分析及基因功能分析,通过对目标序列的生物信息学分析、表达特性分析、转基因植株的抗逆性分析以及在...
【文章页数】：201 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 干旱对植物生长的影响
1.2 植物抗旱性的研究进展
1.2.1 植物的抗旱性与旱后复水恢复生长的调节机制
1.2.2 植物的抗旱性评价体系及提高植物抗逆性的需求和措施
1.3 植物非生物胁迫下的氧化还原调节系统
1.3.1 非生物胁迫对植物氧化还原系统的影响
1.3.2 非生物胁迫下植物细胞中ROS的产生和代谢
1.4 植物硫氧还蛋白家族(Trxs)及其广泛作用
1.4.1 Trxs功能概况
1.4.2 叶绿体中的Trxs系统
1.4.3 叶绿体中一种类硫氧还蛋白-CDSP32
1.5 植物胞质抗坏血酸过氧化物酶(APX)研究进展
1.6 植物生长素氨基酸水解酶家族(ILR-like)研究进展
1.7 参与植物抗逆性几种胁迫应答因子的研究进展
1.7.1 脯氨酸参与抗逆性的研究进展
1.7.2 甜菜碱参与抗逆性的研究进展
1.7.3 可溶性糖类参与抗逆性的研究进展
1.7.4 脱落酸(ABA)参与抗逆性的研究进展
1.7.5 超氧化物歧化酶(SOD)参与抗逆性的研究进展
1.8 桑树抗逆性及资源应用研究进展
1.8.1 古老的桑树物种及其生存能力
1.8.2 桑树资源应用发展现状
1.8.3 桑树抗旱性分子机制研究进展
1.9 本研究前期工作基础和技术依据
1.9.1 前期工作基础
1.9.2 技术流程
第二章 桑树中MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 基因克隆和序列分析
2.1 引言
2.2 试验材料
2.2.1 植物材料
2.2.2 主要仪器设备
2.2.3 主要试剂及菌株
2.3 试验方法
2.3.1 桑树叶片总RNA提取与鉴定
2.3.2 桑树叶片cDNA合成
2.3.3 基因克隆
2.3.4 序列的生物信息学分析
2.4 结果与分析
2.4.1 桑树中三个基因编码区克隆及测序
2.4.2 核酸和氨基酸序列的生物信息学分析
2.4.3 编码蛋白的系统发育树分析
2.4.4 GO(Gene ontology)数据库预测目标基因功能
2.5 小结
第三章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的表达模式分析及多克隆抗体制备
3.1 引言
3.2 试验材料
3.2.1 植物材料与胁迫处理
3.2.2 主要试剂耗材及仪器
3.3 试验方法
3.3.1 总RNA提取和反转录cDNA
3.3.2 基因定量引物设计
3.3.3 实时荧光定量qRT-PCR
3.3.4 叶片含水量测定
3.3.5 脯氨酸含量测定
3.3.6 原核表达载体的构建
3.3.7 多克隆抗体制备
3.3.8 多克隆抗体效价检测
3.3.9 数据统计分析
3.4 结果与分析
3.4.1 基因在桑树地上部分组织的表达规律
3.4.2 基因在不同桑树品种中的表达规律
3.4.3 基因在桑树中的生物钟节律表达规律
3.4.4 盐胁迫对基因表达水平的影响
3.4.5 高温胁迫对基因表达水平的影响
3.4.6 水分胁迫对基因表达水平的影响
3.4.7 施加外源ABA对基因表达水平的影响
3.4.8 施加外源乙烯利对基因表达水平的影响
3.4.9 施加外源水杨酸对基因表达水平的影响
3.4.10 氨基酸序列的抗原性分析
3.4.11 基因表达与蛋白纯化
3.4.12 多克隆抗体效价检测
3.5 小结
第四章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的瞬时表达分析
4.1 引言
4.2 试验材料
4.3 试验方法
4.3.1 植物表达载体构建
4.3.2 重组质粒转化农杆菌
4.3.3 基因瞬时转化桑叶的处理方式
4.3.4 qRT-PCR检测基因表达量
4.3.5 叶片中H2O2和O2
-的含量测定
4.3.6 转化烟草的亚细胞定位分析
4.3.7 数据统计分析
4.4 结果与分析
4.4.1 基因瞬时转化浸染后离体桑叶的状态
4.4.2 基因产物的亚细胞定位
4.4.3 瞬时表达MaCDSP32 基因对离体桑叶持水能力的影响
4.4.4 MaCDSP32 瞬时表达离体桑叶的自然失水情况
4.4.5 NaCl胁迫下离体桑叶气孔开度的变化
4.4.6 PEG胁迫下离体桑叶气孔开度的变化
4.4.7 PEG处理下胁迫相关基因表达量的变化
4.4.8 NaCl处理下胁迫相关基因表达量的变化
4.4.9 基因产物的亚细胞定位确认
4.5 小结
第五章 桑树MaCDSP32 转化烟草的功能研究
5.1 引言
5.2 试验材料
5.2.1 植物材料和生长条件
5.2.2 主要试剂和耗材
5.2.3 主要仪器
5.3 试验方法
5.3.1 叶盘法转化烟草及转基因烟草鉴定
5.3.2 MaCDSP32 表达产物亚细胞定位
5.3.3 转基因烟草非生物胁迫处理
5.3.4 转基因烟草种子萌发和幼苗生长处理
5.3.5 丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和甜菜碱含量测定
5.3.6 叶片中ROS的组织定位和含量测定
5.3.7 SOD、APX、POD和 CAT抗氧化酶活性测定
5.3.8 光合作用气体交换参数测定
5.3.9 叶绿色素含量测定
5.3.10 数据统计分析
5.4 结果与分析
5.4.1 CDSP32序列在桑树和烟草中的同源性比对
5.4.2 阳性转基因烟草PCR鉴定
5.4.3 MaCDSP32 表达产物的亚细胞定位
5.4.4 MaCDSP32 对转基因烟草抗逆性的影响
5.5 小结
第六章 桑树MaCDSP32 转化拟南芥的功能研究
6.1 引言
6.2 试验材料
6.2.1 植物材料和生长条件
6.2.2 主要试剂和耗材
6.2.3 主要仪器
6.3 试验方法
6.3.1 构建MaCDSP32 过表达拟南芥植株
6.3.2 突变体拟南芥T-DNA插入鉴定
6.3.3 转基因拟南芥种子胁迫处理
6.3.4 转基因拟南芥植株非生物胁迫处理
6.3.5 生理生化指标测定
6.3.6 拟南芥叶片气孔开度测量
6.3.7 数据统计分析
6.4 结果与分析
6.4.1 MaCDSP32和AtCDSP32 序列同源性分析
6.4.2 AtCDSP32 突变体拟南芥植株鉴定
6.4.3 转基因拟南芥株系在非生物胁迫下的抗逆性分析
6.4.4 干旱胁迫对转基因拟南芥气孔开度的影响
6.4.5 非生物胁迫对转基因拟南芥抗氧化物酶活性的影响
6.4.6 非生物胁迫对拟南芥抗氧化物酶编码基因表达量的影响
6.4.7 渗透胁迫对拟南芥种子萌发及幼苗生长的影响
6.4.8 MaCDSP32 过表达拟南芥植株的早花现象
6.5 小结
第七章 MaCDSP32 转基因烟草干旱胁迫转录组数据分析
7.1 引言
7.2 试验材料
7.2.1 植物材料
7.2.2 胁迫处理方式及取样
7.3 试验方法
7.3.1 样品转录组文库构建
7.3.2 上机测序
7.3.3 信息分析流程
7.4 结果与分析
7.4.1 OE和WT烟草干旱样品转录组数据总体分析
7.4.2 OE和WT烟草干旱转录组样品差异表达基因分析
7.4.3 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因维恩图
7.4.4 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因聚类热图
7.4.5 OE和WT烟草干旱差异表达基因GO富集分析
7.4.6 OE和WT烟草复水差异表达基因KEGG通路分析
7.4.7 半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径差异基因KEGG通路分析
7.4.8 淀粉和糖代谢途径差异基因KEGG通路分析
7.4.9 油菜素类固醇代谢途径差异基因KEGG通路分析
7.4.10 植物激素信号传导代谢途径差异基因KEGG通路分析
7.4.11 光合元件固碳作用代谢途径差异基因KEGG通路分析
7.4.12 硫代谢途径差异基因KEGG通路分析
7.5 干旱和复水相反生理参数涉及差异表达基因GO富集分析
7.6 小结
第八章 结论
8.1 本研究总结
8.2 本研究创新点
8.3 有待进一步研究的问题
参考文献
附录
致谢
个人简历
本文编号：3871248
【文章页数】：201 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 干旱对植物生长的影响
1.2 植物抗旱性的研究进展
1.2.1 植物的抗旱性与旱后复水恢复生长的调节机制
1.2.2 植物的抗旱性评价体系及提高植物抗逆性的需求和措施
1.3 植物非生物胁迫下的氧化还原调节系统
1.3.1 非生物胁迫对植物氧化还原系统的影响
1.3.2 非生物胁迫下植物细胞中ROS的产生和代谢
1.4 植物硫氧还蛋白家族(Trxs)及其广泛作用
1.4.1 Trxs功能概况
1.4.2 叶绿体中的Trxs系统
1.4.3 叶绿体中一种类硫氧还蛋白-CDSP32
1.5 植物胞质抗坏血酸过氧化物酶(APX)研究进展
1.6 植物生长素氨基酸水解酶家族(ILR-like)研究进展
1.7 参与植物抗逆性几种胁迫应答因子的研究进展
1.7.1 脯氨酸参与抗逆性的研究进展
1.7.2 甜菜碱参与抗逆性的研究进展
1.7.3 可溶性糖类参与抗逆性的研究进展
1.7.4 脱落酸(ABA)参与抗逆性的研究进展
1.7.5 超氧化物歧化酶(SOD)参与抗逆性的研究进展
1.8 桑树抗逆性及资源应用研究进展
1.8.1 古老的桑树物种及其生存能力
1.8.2 桑树资源应用发展现状
1.8.3 桑树抗旱性分子机制研究进展
1.9 本研究前期工作基础和技术依据
1.9.1 前期工作基础
1.9.2 技术流程
第二章 桑树中MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 基因克隆和序列分析
2.1 引言
2.2 试验材料
2.2.1 植物材料
2.2.2 主要仪器设备
2.2.3 主要试剂及菌株
2.3 试验方法
2.3.1 桑树叶片总RNA提取与鉴定
2.3.2 桑树叶片cDNA合成
2.3.3 基因克隆
2.3.4 序列的生物信息学分析
2.4 结果与分析
2.4.1 桑树中三个基因编码区克隆及测序
2.4.2 核酸和氨基酸序列的生物信息学分析
2.4.3 编码蛋白的系统发育树分析
2.4.4 GO(Gene ontology)数据库预测目标基因功能
2.5 小结
第三章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的表达模式分析及多克隆抗体制备
3.1 引言
3.2 试验材料
3.2.1 植物材料与胁迫处理
3.2.2 主要试剂耗材及仪器
3.3 试验方法
3.3.1 总RNA提取和反转录cDNA
3.3.2 基因定量引物设计
3.3.3 实时荧光定量qRT-PCR
3.3.4 叶片含水量测定
3.3.5 脯氨酸含量测定
3.3.6 原核表达载体的构建
3.3.7 多克隆抗体制备
3.3.8 多克隆抗体效价检测
3.3.9 数据统计分析
3.4 结果与分析
3.4.1 基因在桑树地上部分组织的表达规律
3.4.2 基因在不同桑树品种中的表达规律
3.4.3 基因在桑树中的生物钟节律表达规律
3.4.4 盐胁迫对基因表达水平的影响
3.4.5 高温胁迫对基因表达水平的影响
3.4.6 水分胁迫对基因表达水平的影响
3.4.7 施加外源ABA对基因表达水平的影响
3.4.8 施加外源乙烯利对基因表达水平的影响
3.4.9 施加外源水杨酸对基因表达水平的影响
3.4.10 氨基酸序列的抗原性分析
3.4.11 基因表达与蛋白纯化
3.4.12 多克隆抗体效价检测
3.5 小结
第四章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的瞬时表达分析
4.1 引言
4.2 试验材料
4.3 试验方法
4.3.1 植物表达载体构建
4.3.2 重组质粒转化农杆菌
4.3.3 基因瞬时转化桑叶的处理方式
4.3.4 qRT-PCR检测基因表达量
4.3.5 叶片中H2O2和O2
-的含量测定
4.3.6 转化烟草的亚细胞定位分析
4.3.7 数据统计分析
4.4 结果与分析
4.4.1 基因瞬时转化浸染后离体桑叶的状态
4.4.2 基因产物的亚细胞定位
4.4.3 瞬时表达MaCDSP32 基因对离体桑叶持水能力的影响
4.4.4 MaCDSP32 瞬时表达离体桑叶的自然失水情况
4.4.5 NaCl胁迫下离体桑叶气孔开度的变化
4.4.6 PEG胁迫下离体桑叶气孔开度的变化
4.4.7 PEG处理下胁迫相关基因表达量的变化
4.4.8 NaCl处理下胁迫相关基因表达量的变化
4.4.9 基因产物的亚细胞定位确认
4.5 小结
第五章 桑树MaCDSP32 转化烟草的功能研究
5.1 引言
5.2 试验材料
5.2.1 植物材料和生长条件
5.2.2 主要试剂和耗材
5.2.3 主要仪器
5.3 试验方法
5.3.1 叶盘法转化烟草及转基因烟草鉴定
5.3.2 MaCDSP32 表达产物亚细胞定位
5.3.3 转基因烟草非生物胁迫处理
5.3.4 转基因烟草种子萌发和幼苗生长处理
5.3.5 丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和甜菜碱含量测定
5.3.6 叶片中ROS的组织定位和含量测定
5.3.7 SOD、APX、POD和 CAT抗氧化酶活性测定
5.3.8 光合作用气体交换参数测定
5.3.9 叶绿色素含量测定
5.3.10 数据统计分析
5.4 结果与分析
5.4.1 CDSP32序列在桑树和烟草中的同源性比对
5.4.2 阳性转基因烟草PCR鉴定
5.4.3 MaCDSP32 表达产物的亚细胞定位
5.4.4 MaCDSP32 对转基因烟草抗逆性的影响
5.5 小结
第六章 桑树MaCDSP32 转化拟南芥的功能研究
6.1 引言
6.2 试验材料
6.2.1 植物材料和生长条件
6.2.2 主要试剂和耗材
6.2.3 主要仪器
6.3 试验方法
6.3.1 构建MaCDSP32 过表达拟南芥植株
6.3.2 突变体拟南芥T-DNA插入鉴定
6.3.3 转基因拟南芥种子胁迫处理
6.3.4 转基因拟南芥植株非生物胁迫处理
6.3.5 生理生化指标测定
6.3.6 拟南芥叶片气孔开度测量
6.3.7 数据统计分析
6.4 结果与分析
6.4.1 MaCDSP32和AtCDSP32 序列同源性分析
6.4.2 AtCDSP32 突变体拟南芥植株鉴定
6.4.3 转基因拟南芥株系在非生物胁迫下的抗逆性分析
6.4.4 干旱胁迫对转基因拟南芥气孔开度的影响
6.4.5 非生物胁迫对转基因拟南芥抗氧化物酶活性的影响
6.4.6 非生物胁迫对拟南芥抗氧化物酶编码基因表达量的影响
6.4.7 渗透胁迫对拟南芥种子萌发及幼苗生长的影响
6.4.8 MaCDSP32 过表达拟南芥植株的早花现象
6.5 小结
第七章 MaCDSP32 转基因烟草干旱胁迫转录组数据分析
7.1 引言
7.2 试验材料
7.2.1 植物材料
7.2.2 胁迫处理方式及取样
7.3 试验方法
7.3.1 样品转录组文库构建
7.3.2 上机测序
7.3.3 信息分析流程
7.4 结果与分析
7.4.1 OE和WT烟草干旱样品转录组数据总体分析
7.4.2 OE和WT烟草干旱转录组样品差异表达基因分析
7.4.3 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因维恩图
7.4.4 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因聚类热图
7.4.5 OE和WT烟草干旱差异表达基因GO富集分析
7.4.6 OE和WT烟草复水差异表达基因KEGG通路分析
7.4.7 半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径差异基因KEGG通路分析
7.4.8 淀粉和糖代谢途径差异基因KEGG通路分析
7.4.9 油菜素类固醇代谢途径差异基因KEGG通路分析
7.4.10 植物激素信号传导代谢途径差异基因KEGG通路分析
7.4.11 光合元件固碳作用代谢途径差异基因KEGG通路分析
7.4.12 硫代谢途径差异基因KEGG通路分析
7.5 干旱和复水相反生理参数涉及差异表达基因GO富集分析
7.6 小结
第八章 结论
8.1 本研究总结
8.2 本研究创新点
8.3 有待进一步研究的问题
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