雪柑实生苗生理生化及基因和microRNA表达对缺硼的响应

发布时间：2017-08-12 14:34

  本文关键词：雪柑实生苗生理生化及基因和microRNA表达对缺硼的响应

  更多相关文章： 缺硼 雪柑 碳水化合物 microRNA cDNA-AFLP Illumina测序 生理生化

【摘要】：柑橘为亚热热带果树,土壤淋溶、硼(B)固定、氮磷钙施用不协调及气候等原因致使我国柑橘主产区常出现不同程度的缺硼现象。本研究以缺硼(0μM H3BO3)和对照(10μM H3BO3)处理15周的雪柑实生苗为试验材料,通过沙培试验研究了(1)缺硼对雪柑实生苗生长和根叶生理生化的影响,(2)缺硼胁迫下雪柑根和叶基因的差异表达,(3)缺硼胁迫下雪柑根和叶miRNA差异表达,旨在从生理生化和分子水平阐明柑橘耐缺硼的机制,为柑橘高产优质栽培提供科学依据。1缺硼对雪柑实生苗生长的影响在10 μM H3BO3处理下,雪柑实生苗生长正常,不显示任何缺硼症状,叶片的硼含量介于柑橘叶片硼足够范围(30-100μg g-1 DW),而0 μM B处理降低植株根茎叶干重(DW)及根叶硼含量；0 μMB处理叶片中的硼浓度远低于柑橘叶片足够硼的范围,且0 μMB处理雪柑叶片显示出典型的缺硼症状,基于这些结果,0μM B处理被认为缺硼,10 μM B处理被认为硼充足(对照)。2缺硼对雪柑根叶生理生化的影响处理15周后,研究缺硼对气体交换,碳水化合物、有机酸、氨基酸、可溶性总蛋白、总酚含量及有机酸和氨基酸代谢过程中相关酶活性的影响。研究发现缺硼叶片有较多的碳水化合物和较低的CO2同化,可能是碳水化合物对光合作用的反馈抑制作用。缺硼提高了叶片呼吸速率、大部分有机酸(苹果酸、柠檬酸、草酰乙酸、丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸)含量及参与糖酵解、三羧酸(TCA)循环、回补途径的酶(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、NAD-苹果酸脱氢酶、NAD-苹果酸酶、NADP-苹果酸酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酶、柠檬酸合成酶、乌头酸酶、NADP-异柠檬酸脱氢酶和己糖激酶)活性。总游离氨基酸含量和相关代谢酶(NADH-谷氨酸2-酮戊二酸转氨酶和谷氨酸草酰乙酸转氨酶)活性在缺硼叶片中也增强。反之,呼吸速率、非结构碳水化合物、有机酸(苹果酸、柠檬酸、丙酮酸)及氨基酸含量在缺硼根系中减少,参与糖酵解、TCA循环、回补途径的大部分代谢酶(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、NADP-苹果酸酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酶、柠檬酸合成酶、乌头酸酶、NAD-异柠檬酸脱氢酶、NADP-异柠檬酸脱氢酶和己糖激酶]和氨基酸代谢酶(硝酸还原酶、NADH-谷氨酸2-酮戊二酸转氨酶、谷氨酸丙酮酸转氨酶和谷氨酰胺合成酶]活性也相应降低。但是根系和叶片中的总酚(可溶性总蛋白)含量均增加(降低)。总之,呼吸作用、有机酸代谢、回补途径和氨基酸合成在非结构碳水化合物累积的缺硼叶片中增强,以消耗过量的碳源,在根系中降低以保持碳平衡。3雪柑根叶缺硼响应基因分离与鉴定应用cDNA-AFLP,从缺硼叶片(根系)中分别分离出了54(38)个基因表达上调,和38(45)个基因下调表达,这些差异基因功能主要涉及蛋白和氨基酸代谢、碳水化合物和能量代谢、核酸代谢、细胞转运、信号转导和逆境响应。这些基因中大部分都是只从根系或叶片中分离获得,只有7个(XP 006484536.1、XP_006488862.1、XP_007042812.1、XP_007043058.1、NP_564354.1、XP_006492455.1和BAF01964.1)相同的基因在根系和叶片中具有相同的基因库注释ID号,其中有三个(XP_006484536.1、NP_564354.1和XP 006492455.1)基因在根叶中的表达趋势一致以响应缺硼胁迫。显然,缺硼胁迫下根系和叶片中的基因表达呈现出巨大的差异性。比如：UDP-糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases, UGTs)的表达在缺硼根系中上调,在缺硼叶片中被下调；然而,ATP合成酶在前者被上调,但在后者不受影响。所有参与信号转导的缺硼响应基因在根系中被下调,但在缺硼叶片中,除一个基因外,其余差异基因均被上调。在缺硼叶片中,除一个基因外,所有与泛素化和蛋白水解有关的基因均被诱导；然而在缺硼根系中,仅发现了二个与泛素化有关基因的表达被下调。参与逆境防御的基因在缺硼根系中被下调,但在缺硼叶片中除一个基因外,其余差异基因表达均被上调。4雪柑根系缺硼响应microRNAs分离及鉴定通过Illumina测序,本研究从缺硼根系中分离了52个(40个保守和12个未知)上调表达的和82个(72个保守和10个未知)下调表达的miRNAs,表明了根系具有巨大的代谢灵活性,这可能有助于植株的耐缺硼性。MiRNAs可能通过以下几个方面来调节根系对缺硼的适应性：(a)上调miR474表达,下调miR782和miR843表达,激活防御反应、ROS信号和清除；(6)降低miR5023以增加侧根数量,增强miR394表达量以保持有利于缺硼适应的表型；(c)降低miR830、 miR5266和miR3465表达,增强细胞运输；(d)改善渗透调节(miR474),调节其它代谢反应(miR5023和miR821)；(e)增强根系中miR472和miR2118表达,降低与疾病抵抗相关靶基因表达,从而降低根系的抗病性。5雪柑叶片缺硼响应microRNAs分离及鉴定通过Illumina测序,本研究从缺硼和正常供硼叶片中各分离出91个(83个保守和8个未知)上调表达的和81个(75个保守和6个未知)下调表达的miRNAs,表明了缺硼大大地改变了niRNAs表达,这可能有利于柑橘对缺硼的适应性。叶片miRNAs对缺硼的适应性可能主要有以下几个方面：(a)通过改变miR393、miR160和miR3946的表达,降低TIR1水平和ARF介导的基因表达,从而抑制生长素信号,弱化植株生长和发育,因而增强植物胁迫耐受性；(6)下调miR159、miR782、miR3946和miR7539,上调MYBs表达,维持适宜的叶片表型,增强植物胁迫抵抗能力；(c)下调miR164、miR6260、miR5929、 miR6214、miR3946和miR3446转录水平,活化胁迫响应和抗氧化系统；(d)增强miR5037表达,降低主要协助转运蛋白超家族(MFS)基因转录水平,从而减弱硼从植物运出；(e)下调miR408,调节铜平衡、增强超氧化物岐化酶(SOD)活性,参与植物耐缺硼抗性。
【关键词】：缺硼 雪柑 碳水化合物 microRNA cDNA-AFLP Illumina测序 生理生化
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S666.1
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第一章 文献综述13-32
• 1 土壤中硼营养概述13-14
• 2 植物的硼营养概述14-22
• 2.1 硼在植物中的分布与含量14
• 2.2 硼对植物生长的影响14-16
• 2.3 缺硼胁迫下植物的生理响应16-20
• 2.4 柑橘缺硼研究进展20-21
• 2.5 植物耐缺硼的分子机理21-22
• 3 植物中的miRNA研究进展22-28
• 3.1 植物miRNA的形成和作用机制23-24
• 3.2 植物miRNA功能24-27
• 3.3 植物miRNA的研究方法27-28
• 4 cDNA-AFLP技术应用研究进展28-30
• 5 立题意义30
• 6 研究内容及技术路线30-32
• 6.1 研究内容30-31
• 6.2 技术路线31-32
• 第二章 缺硼对雪柑实生苗主要生理生化代谢的影响32-48
• 1 材料与方法33-35
• 1.1 试验材料培养与硼处理33
• 1.2 生物量的测定33
• 1.3 根系、叶片硼含量的测定33-34
• 1.4 叶片光合作用和根系、叶片呼吸速率的测定34
• 1.5 根系和叶片有机酸含量测定方法34
• 1.6 有机酸相关代谢酶活性测定34
• 1.7 总酚、可溶性总蛋白和总游离氨基酸的测定34
• 1.8 根系和叶片中氨基酸代谢关键酶的测定34-35
• 1.9 试验设计和统计分析35
• 2 结果与分析35-45
• 2.1 生物量和根叶硼含量35-36
• 2.2 叶片和根系气体交换36
• 2.3 根叶中主要代谢产物的含量和关键酶的活性36-45
• 3 讨论45-47
• 3.1 非结构性碳水化合物在缺硼叶片中增加,在缺硼根系中减少45
• 3.2 缺硼导致雪柑叶片呼吸、有机酸代谢和回补途径上调,而在根系中下调45-46
• 3.3 缺硼下,根系氨基酸合成下调,叶片氨基酸合成则上调46
• 3.4 缺硼增加根系和叶片酚类物质累积46-47
• 4 小结47-48
• 第三章 缺硼胁迫下雪柑根叶cDNA-AFLP分析48-76
• 1 材料与方法48-52
• 1.1 试验材料培养与硼处理48-49
• 1.2 植株生物量、根系和叶片硼含量的测定49
• 1.3 RNA的提取与检测49
• 1.4 cDNA的合成49
• 1.5 cDNA的酶切及连接49
• 1.6 预扩增及选择性扩增49-50
• 1.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳50
• 1.8 差异片段的回收、测序及比对50-51
• 1.9 差异片段的荧光定量PCR验证51
• 1.10 试验设计和统计分析51-52
• 2 结果与分析52-63
• 2.1 缺硼对雪柑营养生长、根叶中B含量影响52-53
• 2.2 缺硼雪柑根叶基因表达差异53-54
• 2.3 根系和叶片中差异表达基因功能分析54-62
• 2.4 cDNA-AFLP荧光定量验证62-63
• 3 讨论63-72
• 3.1 缺硼相关基因在柑橘根系、叶片中的差异63
• 3.2 参与碳水化合物和能量代谢的基因63-64
• 3.3 参与核酸代谢的基因64-66
• 3.4 参与蛋白和氨基酸代谢的基因66-68
• 3.5 参与细胞运输的基因68-69
• 3.6 参与信号转导的基因69-70
• 3.7 参与胁迫响应和防御的基因70-71
• 3.8 参与脂质代谢的基因71
• 3.9 参与细胞壁修饰的基因71-72
• 3.10 参与其它代谢的基因72
• 4 小结72-76
• 第四章 雪柑根系缺硼响应microRNAs分离及鉴定76-95
• 1 材料与方法76-83
• 1.1 试验材料培养与硼处理76
• 1.2 生物量及根系和叶片硼含量的测定76
• 1.3 根系类黄酮、花青素、脯氨酸、脯氨酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶测定76-77
• 1.4 sRNAs的富集、文库的构建和高通量测序77
• 1.5 sRNA注释和miRNA鉴定77-78
• 1.6 缺硼胁迫下miRNAs表达量差异分析78
• 1.7 MiRNAs靶基因预测78-79
• 1.8 差异表达miRNAs靶基因功能分析79
• 1.9 荧光定量PCR79-81
• 1.10 试验设计及数据分析81-83
• 2 结果与分析83-90
• 2.1 植株生长及根叶中硼元素的测定83
• 2.2 根系高通量测序及miRNAs文库分析83-84
• 2.3 根系中保守miRNAs的鉴定84
• 2.4 根系中新的miRNAs的预测84
• 2.5 缺硼根系中差异表达miRNAs84-85
• 2.6 实时荧光定量PCR检测miRNA表达量85
• 2.7 差异表达miRNAs靶基因的预测85-88
• 2.8 实时荧光定量PCR检测靶基因的表达88
• 2.9 根系代谢物及酶活性88-90
• 3 讨论90-93
• 4 小结93-95
• 第五章 雪柑叶片缺硼响应microRNAs的分离及鉴定95-115
• 1 材料与方法96-101
• 1.1 试验材料培养与硼处理96
• 1.2 sRNAs的富集、文库的构建和高通量测序96
• 1.3 sRNA注释和miRNA鉴定96
• 1.4 缺硼胁迫下miRNAs表达量差异分析96
• 1.5 MiRNAs靶基因预测96
• 1.6 差异表达miRNAs靶基因功能分析96
• 1.7 荧光定量PCR96-101
• 1.8 试验设计及数据分析101
• 2 结果与分析101-109
• 2.1 叶片中硼及铜元素测定101
• 2.2 叶片高通量测序及miRNAs文库分析101-102
• 2.3 雪柑叶片中保守的和未知miRNAs鉴定102-103
• 2.4 雪柑叶片中缺硼相关miRNAs鉴定103
• 2.5 差异表达miRNAs靶基因的鉴定及其GO分析103-105
• 2.6 实时荧光定量PCR验证miRNA表达量105
• 2.7 实时荧光定量PCR验证靶基因表达量105-109
• 3 讨论109-114
• 4 小结114-115
• 第六章 总结与展望115-118
• 参考文献118-146
• 附录146-271
• 致谢271-272
• 硕博期间发表论文情况272

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1 卢艺彬;雪柑实生苗生理生化及基因和microRNA表达对缺硼的响应[D];福建农林大学;2015年

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本文编号：662102