HDAC6缓解神经毒性多肽诱导神经元死亡机制的研究

发布时间：2017-08-16 21:30

  本文关键词：HDAC6缓解神经毒性多肽诱导神经元死亡机制的研究

  更多相关文章： 朊病毒病 PrP106-126 自噬 HDAC6 PI3K-Akt-mTOR

【摘要】：传染性海绵状脑病又称朊病毒病,是一种渐进性、致死性的神经退化性疾病,该类疾病的主要特征是脑组织海绵状空泡化、神经元死亡和胶质细胞增多。该病的致病机理主要是由于正常细胞型朊蛋白(PrPc)发生错误折叠转变为致病型朊蛋白(PrPSc)所导致的。自噬溶酶体途径是降解错误折叠的蛋白和损伤的线粒体来抵抗神经退化的重要降解系统,并且,有研究发现一些自噬的药物增强剂能够在体内和体外促进prpSc的清除。HDAC6是近年来在其他神经退化性疾病中研究比较多的一种组蛋白脱乙酰酶,区别于其他组蛋白酶家族成员,它除了含有组蛋白脱乙酰酶结构外还含有一个ZnF-UBP结构,这使得该蛋白可以结合泛素化的错误折叠蛋白,这些结构使得HDAC6具有多样化的功能,近年来已经成为研究神经退化性疾病的发病机理和治疗的靶点。本研究试图探索HDAC6在Prion疾病中的功能,从而为研究Prion疾病的致病机理和治疗提供新的研究思路。首先,本文研究了PrP106-126作用下的神经元内HDAC6的表达和定位以及HDAC6对于PrP106-126神经毒性的影响。而后本文研究了在PrP106-126作用下,HDAC6对自噬及PI3K-Akt-mTOR信号通路的影响。研究结果发现：(1)PrP106-126改变HDAC6的表达,促进HDAC6转运到细胞核周围,并且参与调节PrP106-126的神经毒性；抑制HDAC6的脱乙酰酶活性或者RNA干扰降低HDAC6的表达能够明显地增加PrP106-126导致的神经元死亡,而过表达HDAC6则可以减少PrP106-126造成的神经元死亡,这表明HDAC6参与神经元抵抗PrP106-126的神经毒性。(2)研究发现,自噬抑制剂3-MA和Bafilomycin Al可以阻止HDAC6的神经保护作用,这表明HDAC6缓解PrP106-126诱导的神经元死亡涉及自噬的参与；进一步的研究发现在PrP106-126的作用下,过表达HDAC6可以增强神经元的自噬流,而抑制HDAC6的活性或者shRNA干扰HDAC6的表达则会抑制神经元的自噬。(3)进一步的研究发现,在PrP106-126的作用下的原代神经元中过表达HDAC6可以降低磷酸化mTORC1和磷酸化p70S6K；然而,RNA干扰HDAC6的表达则会增加磷酸化mTORC 1和磷酸化p70S6K。为了进一步研究HDAC6对mTORC 1上游PI3K-Akt信号通路的影响,我们检测了HDAC6对促生长因子Akt的调节作用。结果发现,HDAC6参与调节Akt的磷酸化,过表达HDAC6可以增加磷酸化的Akt,相反地,降低HDAC6的表达则导致磷酸化Akt的减少。细胞活力检测结果表明,PI3K-Akt的抑制剂Wortmanin也可以阻止HDAC6的神经保护作用,而PI3K-Akt的激活剂IGF-1则可以明显增加HDAC6干扰后的神经元存活率,这表明HDAC6通过调节Akt的激活来发挥神经保护机制的。综上所述,本研究证明,HDAC6可以通过调节PI3K-Akt-mTOR信号通路来保护神经元抵抗PrP106-126的神经毒性；
【关键词】：朊病毒病 PrP106-126 自噬 HDAC6 PI3K-Akt-mTOR
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.3
【目录】：

• 中文摘要4-5
• ABSTRACT5-11
• 英文缩写表11-13
• 第一章 文献综述13-33
• 1.1 传染性海绵状脑病的概述13-15
• 1.1.1 传染性和海绵状脑病的特征及分类13-14
• 1.1.2 TSEs的发展历史14-15
• 1.2 朊蛋白的生理功能15-21
• 1.2.1 PrP~C的结构15-16
• 1.2.2 PrP~C的生物学功能16-19
• 1.2.3 PrP~C向PrP~(Sc)的转化机制19-21
• 1.3 感染机制21-23
• 1.3.1 朊病毒进入体内的方式21-22
• 1.3.2 朊病毒进入神经系统的途径22-23
• 1.4 自噬在朊病毒中的作用23-28
• 1.4.1 自噬的分类及特点23-25
• 1.4.2 自噬的调节25-27
• 1.4.3 疾病相关的选择性自噬27-28
• 1.5 HDAC6在神经退化性疾病中的功能28-31
• 1.5.1 HDAC6作为脱乙酰酶的功能28-29
• 1.5.2 HDAC6在细胞应对错误折叠的聚集体蛋白中的作用29-31
• 1.5.3 HDAC6作为压力存活因子31
• 1.6 朊蛋白的神经毒性形式31
• 1.7 本研究的目的和意义31-33
• 第二章 HDAC6负调节PRP106-126诱导的神经元死亡33-52
• 引言33
• 2.1 材料33-38
• 2.1.1 细胞33-34
• 2.1.2 主要试剂34-35
• 2.1.3 实验所用溶液的配制35-37
• 2.1.4 主要仪器及设备37-38
• 2.2 实验方法38-45
• 2.2.1 小鼠原代皮质神经元的分离培养38
• 2.2.2 HA-HDAC6重组表达质粒的构建38-41
• 2.2.3 无内毒素重组质粒HDAC6-HA的大量提取41-42
• 2.2.4 HDAC6-HA的质粒、shRNA-HDAC6的质粒转染原代神经元42-43
• 2.2.5 PrP106-126刺激神经元43
• 2.2.6 FITC-PrP106-126刺激神经元43
• 2.2.7 PrP106-126与HDAC6的特异性抑制剂Tubacin共同作用神经元43
• 2.2.8 HDAC6蛋白的检测43-44
• 2.2.9 免疫荧光检测HDAC6的定位44
• 2.2.10 细胞活力的检测44-45
• 2.2.11 统计学分析45
• 2.3 实验结果45-50
• 2.3.1 小鼠大脑皮质神经元的分离培养及鉴定45-46
• 2.3.2 小鼠HDAC6基因的PCR扩增46
• 2.3.3 重组质粒HDAC6-HA的鉴定46-47
• 2.3.4 PrP106-126改变神经元内HDAC6的表达47-48
• 2.3.5 PrP106-126与神经元内的HDAC6共定位48-49
• 2.3.6 HDAC6参与调节PrP106-126诱导的神经元死亡49-50
• 2.4 分析与讨论50-52
• 第三章 自噬在HDAC6负调节PRP106-126诱导的神经元死亡中的作用52-63
• 引言52
• 3.1 材料52-56
• 3.1.1 小鼠大脑皮质神经元的分离培养53
• 3.1.2 主要试剂53
• 3.1.3 实验所用溶液的配制53-56
• 3.1.4 主要仪器及设备56
• 3.2 实验方法56-59
• 3.2.1 HDAC6-HA的质粒、shRNA-HDAC6的质粒转染原代神经元56-57
• 3.2.2 PrP106-126刺激神经元57
• 3.2.3 PrP106-126分别与自噬的激活剂和抑制剂共刺激神经元57
• 3.2.4 细胞内LC3-Ⅱ的检测57-58
• 3.2.5 细胞活力检测58
• 3.2.6 透射电镜观察PrP106-126作用过表达HDAC6的神经元的自噬情况58
• 3.2.7 统计学分析58-59
• 3.3 实验结果59-62
• 3.3.1 过表达HDAC6可以增强自噬59-60
• 3.3.2 抑制HDAC6的活性可以降低自噬60-61
• 3.3.3 透射电镜观察过表达HDAC6对神经元自噬的影响61-62
• 3.4 分析与讨论62-63
• 第四章 PI3K-AKT-MTOR信号通路在HDAC6负调节PRP106-126诱导的神经元死亡中的作用63-76
• 引言63
• 4.1 材料63-67
• 4.1.1 小鼠大脑皮质神经元的分离培养63
• 4.1.2 主要试剂63-64
• 4.1.3 实验所用溶液的配制64-66
• 4.1.4 主要仪器及设备66-67
• 4.2 实验方法67-70
• 4.2.1 HDAC6-HA的质粒、shRNA-HDAC6的质粒转染原代神经元67-68
• 4.2.2 PrP106-126刺激神经元68
• 4.2.3 PrP106-126与Tubacin和PI3K-Akt抑制剂Wortmanin共刺激神经元68
• 4.2.4 细胞内Phospho-mTOR、Phspho-Akt、Phospho-70S6K的检测68-69
• 4.2.5 免疫荧光检测Phospho-Akt69
• 4.2.6 细胞活力检测69-70
• 4.2.7 统计学分析70
• 4.3 实验结果70-74
• 4.3.1 HDAC6通过抑制mTOR的活性来增强自噬70-71
• 4.3.2 过表达HDAC6可以激活Akt71-73
• 4.3.3 抑制HDAC6降低磷酸化的Akt73-74
• 4.4 分析与讨论74-76
• 结论76-77
• 创新点77-78
• 参考文献78-91
• 致谢91-92
• 个人简介92

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本文编号：685634