肉苁蓉主要药用成分相关基因的挖掘及分子标记的鉴定

发布时间：2017-09-10 15:49

  本文关键词：肉苁蓉主要药用成分相关基因的挖掘及分子标记的鉴定

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【摘要】：肉苁蓉是一种非光合作用的寄生植物,主要分布于我国西北荒漠地区。肉苁蓉的干燥肉质茎是我国传统的名贵中药材,具有广泛的药用价值,如增强性功能、提高免疫力等。但目前肉苁蓉的转录组与基因组数据还很匮乏。在本研究中,我们对肉苁蓉肉质茎进行了全转录组深度测序,共获得80M末端配对序列。使用Trinity软件进行转录本从头拼接,获得95,787个转录本,长度从200bp到15,698bp不等,平均长度为950bp。在63,957个表达转录本(FPKM≥0.5)中,30,098个转录本可以通过与公共数据库(Uniprot、 Genbank nt/nr、KEG G)比较获得基因的功能注释信息。通过与KEGG数据库比较,我们注释到了参与木质素生物合成途径的所有酶。苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)是木质素与苯乙醇苷(PhGs)生物合成的第一个关键酶,根据序列相似性比较与系统发生分析,鉴定出了肉苁蓉的至少4个PAL基因。PhGs是肉苁蓉的主要药用成分,根据转录本表达信息,我们首次推测出了肉苁蓉PhGs的两个可能的生物合成途径。为了进一步研究不同种质肉苁蓉肉质茎药用成分与基因表达的差异,我们采集了多个不同种质的肉苁蓉肉质茎进行药化测定与转录组测序。不同样本的长度与直径差别较大；左旗三个样本在重量方面差别不大,但右旗的三个样本差异较大。采用HPLC测定各样本的毛蕊花糖苷、松果菊苷与总苷,右旗样本的PhGs含量普遍高于左旗样本。同时,对六个样本分别进行全转录组深度测序,将数据混合起来用Trini ty软件进行拼接,共获得337,132个转录本,平均长度为1,125bp。在156,877个活跃表达的转录本(FPKM≥0.5)中,72,186个转录本可以通过与Genbank nt/nr数据库比较获得基因功能的注释信息。通过样本之间表达转录本的比较分析发现,样本间共表达的转录本要远多于样本特异表达的转录本。两两样本间的差异表达转录本分析结果表明：右旗样本间的表达差异要小于左旗样本间。根据差异表达转录本的聚类结果,共筛选出10个明显与主要药用成分协同变化的分子标记。此外,我们也进行了转录本的SSR分子标签的分析,1/3的转录本含有SSR,大多数SSR是单核昔酸重复序列。基于转录组数据,我们同时构建了一个公共数据库CISTANCHE DESERTICOLA Genome Databas e。本研究有助于在分子水平理解肉苁蓉的生理过程与药用价值,也有可能用于肉苁蓉品质鉴定与栽培种的选择。
【关键词】：肉苁蓉 肉质茎 苯乙醇苷 转录组 从头拼接 功能注释 基因挖掘 表达转录本 鉴定分子标记
【学位授予单位】：中国科学院北京基因组研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S567.239
【目录】：

• 致谢5-7
• 摘要7-8
• ABSTRACT8-10
• 专业词汇中英文对照表10-14
• 第一章 绪论14-34
• 1.1 研究背景14-19
• 1.1.1 肉苁蓉形态特征与生活习性14-16
• 1.1.2 肉苁蓉的药用价值及主要药用成分16-17
• 1.1.3 肉苁蓉的资源价值、经济价值与发展前景17-18
• 1.1.4 肉苁蓉的研究现状18-19
• 1.2 研究方法19-32
• 1.2.1 高效液相色谱(HPLC)20-22
• 1.2.2 下一代测序技术22-25
• 1.2.3 转录组测序技术(RNA-seq)25-26
• 1.2.4 转录组从头拼接26-30
• 1.2.5 实时荧光定量PCR技术30-32
• 1.3 研究目的与意义32-34
• 第二章 材料与方法34-50
• 2.1 实验样品34
• 2.2 实验试剂与耗材34-36
• 2.2.1 常用溶液与培养基34-35
• 2.2.2 实验试剂与仪器35-36
• 2.3 实验方法36-45
• 2.3.1 肉苁蓉糖苷含量的定量检测36-37
• 2.3.2 RNA提取37
• 2.3.3 RNA-seq测序文库制备与Illumina测序37-43
• 2.3.4 引物设计与实时荧光定量PCR43-45
• 2.4 生物信息分析方法45-50
• 2.4.1 RNA-seq数据分析45
• 2.4.2 基因表达的定量45-46
• 2.4.3 基因表达模式聚类46-47
• 2.4.4 预测转录本的功能47
• 2.4.5 GO与KEGG注释47-48
• 2.4.6 SSR鉴定48-50
• 第三章 结果与讨论50-84
• 3.1 肉苁蓉肉质茎转录组从头拼接与主要药用成分相关基因的挖掘50-64
• 3.1.1 基于高通量测序数据的肉苁蓉肉质茎转录组从头拼接50-52
• 3.1.2 转录本的表达定量及功能注释52-55
• 3.1.3 表达转录本的GO与KEGG注释55-56
• 3.1.4 木质素生物合成基因的挖掘56-58
• 3.1.5 PhGs生物合成相关基因的挖掘58-59
• 3.1.6 小结59-64
• 3.2 两个主要种植地的肉苁蓉转录组的比较分析64-82
• 3.2.1 两个主要种植地的肉苁蓉主要药用成分的定量检测64-66
• 3.2.2 转录本从头拼接与功能注释66-70
• 3.2.3 表达转录本与差异表达转录本的鉴定分析70-76
• 3.2.4 与药用成分协同变化的分子标记的挖掘76-79
• 3.2.5 SSR的鉴定分析79-81
• 3.2.6 肉苁蓉数据库的构建81-82
• 3.2.7 小结82
• 3.3 讨论82-84
• 3.3.1 新一代测序技术在转录组中的应用82-83
• 3.3.2 不同种质肉苁蓉的性状差异与基因表达差异83
• 3.3.3 后续工作展望83-84
• 第四章 结论84-86
• 参考文献86-98
• 附录98-100
• 附图98-100
• 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果100

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本文编号：825183