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大叶落地生根胎生苗差减cDNA文库的构建及相关基因的克隆

发布时间:2017-09-10 19:32

  本文关键词:大叶落地生根胎生苗差减cDNA文库的构建及相关基因的克隆


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【摘要】:大叶落地生根(K. daigremontiana)别名花蝴蝶、倒吊莲、大还魂,是景天科(Crassulaceae)伽蓝菜属(Kalanchoe adans.)中一种极易栽培的观赏植物。大叶落地生根的胎生苗无性繁殖过程,同时具有胚胎发生途径和器官发生途径的特点,由于其不形成种子,而在叶片边缘形成体细胞胚,为研究体细胞胚发生途径、器官发生途径和植物体细胞全能性提供了一个良好的模型。因此,本研究以大叶落地生根胎生苗为研究对象,揭示无性繁殖过程中相关基因的的变化,为进一步阐明大叶落地生根胎生苗无性繁殖的过程提供一个框架和平台,对深入了解无性繁殖的分子机制奠定了理论基础。具体的研究结果如下:1.通过外施植物激素的方法来确定生长素和细胞分裂素在胎生苗发生和发育中的作用。胎生苗是发生在母叶边缘锯齿处2-3 mm范围内的细胞层中,从叶片顶端向叶柄基部逐渐发生,而且沿着叶片中轴对称产生。生长素(2,4-D)对胎生苗无性繁殖的影响较小,起关键作用的激素是细胞分裂素(6-BA),用细胞分裂素抑制剂(PR)完全抑制在切割叶片中胎生苗的产生。而且在发育阶段,细胞分裂素处理过的胎生苗叶片直径明显大于对照和其他处理。2.通过SSH技术来寻找差异表达的功能基因,以着生胎生苗的母叶为测试方(tester),不着生胎生苗的母叶为驱动方(driver),构建大叶落地生根胎生苗差减文库,共富集到481条高质量的序列,拼接成390条一致性序列,包括338条单一序列和52条重叠群序列。有132条序列能够在COG数据库中比对到,分为12个大类。挑选30条基因进行real-time PCR实验,根据实验结果将这些分为5类,说明在胎生苗发生发育过程中的基因表达模式非常复杂,同时也证明无性繁殖是一个复杂的基因调控系统,涉及到大量基因的表达水平的变化。3.对差减文库中的6条基因进行克隆和分析,包括:组氨醇脱氢酶(KdHDH)、谷胱甘肽s-转移酶(KdGST)、F-Box家族蛋白(KdF-box)、S-腺苷高半胱氨酸水解酶(KdSAHH)、谷氨酸脱羧酶(KdGAD)、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(KdCDK)。通过RACE-PCR技术,获得这6个基因的全长。生物信息学结果分析,6个蛋白都没有信号肽,推测它们都不是分泌蛋白,说明这6个蛋白在细胞内起作用。其中,KdSAHH、KdF-box、KdCDK、KdGAD、KdGST是亲水性蛋白,KdHDH是疏水性蛋白。KdSAHH、KdF-box、KdCDK、KdGAD、KdHDH是酸性蛋白质,KdGST是碱性蛋白质。其中,大叶落地生根KdHDH基因ORF长为1452 bp,编码483个氨基酸,具有明显的疏水区域和跨膜结构,LOCTree软件预测定位在叶绿体膜上,与咪唑甘油磷酸脱水酶存在相互作用。大叶落地生根KdGST基因ORF长为1272 bp,编码423个氨基酸,是一个亲水性蛋白,定位于内质网膜上。大叶落地生根KdGAD基因ORF长为1509 bp,编码502个氨基酸,分子大小为56.57 kD。没有明显的疏水区域和跨膜结构。LOCTree软件预测该蛋白定位在细胞核上。大叶落地生根KdCDK基因ORF长为888 bp,编码295个氨基酸,是一个亲水性蛋白,没有明显的跨膜区域,可能定位在细胞质中。大叶落地生根KdF-box基因ORF长为987 bp,编码328个氨基酸,是亲水性蛋白,没有明显的跨膜结构,定位在细胞质中,是非分泌蛋白。大叶落地生根KdSAHH基因ORF长1458 bp,编码485个氨基酸。没有明显的疏水区域和跨膜结构,是一个亲水性蛋白质,定位与细胞质中,属于非分泌蛋白。4. KdSAHH基因在胎生苗无性繁殖过程中上调表达,差异表达量达到4.08倍,该基因无信号肽及跨膜结构域,说明KdSAHH蛋白是一个广谱表达而非膜定位的蛋白,与甲基转移酶基因有相互作用,其它有相互作用的蛋白也都与甲基转移有关。因此,选择KdSAHH基因进行深入研究。成功构建KdSAHH基因的超表达载体、RNAi载体并转化大叶落地生根和烟草,获得转化植株。综上所述,本研究在转录组水平上对大叶落地生根胎生苗无性繁殖过程进行研究,发现大量与无性繁殖相关的基因,通过real-time PCR分析了30个基因的表达模式,通过RACE-PCR克隆出其中6个基因的全长,并进行生物信息学分析,选择KdSAHH基因进行下一步研究,构建KdSAHH基因的超表达载体、RNAi载体转化大叶落地生根和烟草,并成功获得转化植株。本研究的发现为解释大叶落地生根胎生苗无性繁殖的分子机制提供了基因资源和工作平台,充实了大叶落地生根的研究资源,是对大叶落地生根处于初级研究阶段的填补和充实。
【关键词】:大叶落地生根 胎生苗 差减杂交 基因克隆 KdSAHH基因
【学位授予单位】:北京林业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S682.36
【目录】:
  • 摘要4-6
  • Abstract6-9
  • 缩略词9-11
  • 目录11-15
  • 1 引言15-17
  • 2 文献综述17-28
  • 2.1 大叶落地生根的概况17-19
  • 2.1.1 大叶落地生根的来源17-18
  • 2.1.2 大叶落地生根的形态特征18-19
  • 2.1.3 大叶落地生根的栽培繁殖管理19
  • 2.2 伽蓝菜属的分类情况19-20
  • 2.3 大叶落地生根的研究价值20-22
  • 2.3.1 观赏价值20
  • 2.3.2 经济价值20
  • 2.3.3 教学价值20-21
  • 2.3.4 景天酸代谢(CAM)研究模型21
  • 2.3.5 药用价值21-22
  • 2.3.6 抗病虫价值22
  • 2.4 胎生苗模型研究价值22-25
  • 2.4.1 胚胎发生途径的特征23-24
  • 2.4.2 器官发生途径的特征24
  • 2.4.3 胎生苗发生发育过程中基因表达和基因功能24-25
  • 2.5 本研究的目的和内容25-28
  • 2.5.1 研究的目的意义25-26
  • 2.5.2 研究内容26
  • 2.5.3 技术路线26-28
  • 3 生长素和细胞分裂素在大叶落地生根胎生苗发生发育过程中的作用28-41
  • 3.1 实验材料及处理28-30
  • 3.1.1 实验材料28
  • 3.1.2 植物激素的配置28-29
  • 3.1.3 试验处理29
  • 3.1.4 确定胎生苗发生位置29-30
  • 3.1.5 数据统计30
  • 3.2 结果与分析30-38
  • 3.2.1 胎生苗发生位置30-31
  • 3.2.2 不同激素处理诱导产生的胎生苗的表型差异31-33
  • 3.2.3 以完整叶片作为外植体在不同激素处理下诱导产生胎生苗的时间和数量差异33-35
  • 3.2.4 以切割叶片作为外植体在不同激素处理下诱导产生胎生苗的时间和数量差异35-37
  • 3.2.5 不同激素处理对胎生苗发育的影响37-38
  • 3.3 讨论38-39
  • 3.4 小结39-41
  • 4 大叶落地生根胎生苗差减文库的构建及差异基因的表达分析41-63
  • 4.1 实验材料及处理42-44
  • 4.1.1 植物材料42
  • 4.1.2 主要酶与试剂42
  • 4.1.3 主要仪器设备42-43
  • 4.1.4 常用培养基43
  • 4.1.5 Real-time PCR引物的设计43-44
  • 4.2 实验方法44-46
  • 4.2.1 总RNA的提取44
  • 4.2.2 mRNA的分离纯化44
  • 4.2.3 cDNA的合成和RsaI的酶切44
  • 4.2.4 SSH差减文库的构建44-45
  • 4.2.5 测序和生物信息学分析45
  • 4.2.6 荧光定量PCR分析差异基因的表达45-46
  • 4.3 结果与分析46-59
  • 4.3.1 叶片总RNA的完整性及mRNA分离纯化46-47
  • 4.3.2 最佳循环数的优化47-48
  • 4.3.3 cDNA的纯化48-49
  • 4.3.4 RsaⅠ酶切后纯化效率检测49-50
  • 4.3.5 抑制性差减杂交效率分析50-51
  • 4.3.6 差减cDNA文库的构建及阳性克隆的筛选51-52
  • 4.3.7 差减文库的的序列分析52-56
  • 4.3.8 差异基因的表达分析56-59
  • 4.4 讨论59-62
  • 4.4.1 叶片总RNA及mRNA的分离纯化59-60
  • 4.4.2 差减cDNA文库的可靠性60-61
  • 4.4.3 胎生苗无性繁殖过程中涉及到的基因61-62
  • 4.5 小结62-63
  • 5 胎生苗无性繁殖中相关基因的克隆和生物信息学分析63-106
  • 5.1 实验材料及处理63-64
  • 5.1.1 植物材料63
  • 5.1.2 主要酶与试剂63-64
  • 5.1.3 主要仪器设备64
  • 5.1.4 常用培养基64
  • 5.2 实验方法64-80
  • 5.2.1 总RNA的提取64
  • 5.2.2 组氨醇脱氢酶(histidinol dehydrogenase;KdHDH)基因的克隆64-71
  • 5.2.3 谷胱甘肽s-转移酶(glutathione S-transferase;KdGST)基因的克隆71-72
  • 5.2.4 谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase;KdGAD)基因的克隆72-73
  • 5.2.5 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin dependent kinase;KdCDK)基因的克隆73-74
  • 5.2.6 F-Box家族蛋白(F-box family protein;KdF-box)基因的克隆74-75
  • 5.2.7 S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocystrine hydrolase:KdSAHH)基因的克隆75-79
  • 5.2.8 获得序列的生物信息学分析79-80
  • 5.3 结果与分析80-104
  • 5.3.1 组氨醇脱氢酶(KdHDH)基因克隆与生物信息学分析80-84
  • 5.3.2 谷胱甘肽s-转移酶(KdGST)基因克隆与生物信息学分析84-88
  • 5.3.3 谷氨酸脱羧酶(KdGAD)基因克隆与生物信息学分析88-92
  • 5.3.4 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(KdCDK)基因克隆与生物信息学分析92-96
  • 5.3.5 F-Box家族蛋白(KdF-box)基因克隆与生物信息学分析96-100
  • 5.3.6 S-腺苷高半胱氨酸水解酶(KdSAHH)基因克隆与生物信息学分析100-104
  • 5.4 讨论104-105
  • 5.5 小结105-106
  • 6 大叶落地生根KdSAHH基因对烟草和大叶落地生根的转化106-124
  • 6.1 实验材料及处理107-108
  • 6.1.1 植物材料107
  • 6.1.2 主要酶与试剂107
  • 6.1.3 植物表达载体107
  • 6.1.4 主要设备107
  • 6.1.5 主要培养基107-108
  • 6.2 实验方法108-117
  • 6.2.1 KdSAHH基因超表达载体的构建108-111
  • 6.2.2 KdSAHH基因全长RNAi载体的构建111-116
  • 6.2.3 KdSAHH基因保守区RNAi载体的构建116
  • 6.2.4 农杆菌感受态的制备及质粒的转化鉴定116
  • 6.2.5 植物表达载体转化大叶落地生根116-117
  • 6.2.6 植物表达载体转化烟草117
  • 6.3 结果与分析117-122
  • 6.3.1 尤基因超表达载体的构建117-118
  • 6.3.2 基因全长RNAi载体的构建118-119
  • 6.3.3 足基因保守区RNAi载体的构建119-120
  • 6.3.4 植物表达载体转化大叶落地生根120-121
  • 6.3.5 植物表达载体转化烟草121-122
  • 6.4 讨论122-123
  • 6.5 小结123-124
  • 7 结论与展望124-127
  • 7.1 结论124
  • 7.2 创新点124-125
  • 7.3 展望125-127
  • 参考文献127-135
  • 附图135-136
  • 个人简介136-137
  • 获得成果目录137-138
  • 导师简介138-139
  • 致谢139-14

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