关于NP-5基因在不同组织下mRNA的表达与新西兰兔消化道紊乱讨论
发布时间：2014-09-12 21:31
【摘要】 随着规模化养兔业的发展,家兔消化道紊乱特别是非特异性消化道紊乱(non-specific digestive disorders)制约着整个兔产业的发展,腹泻是家兔非特异性消化道紊乱的主要临床症状。防御素作为一种阳离子抗菌肽在先天性免疫和获得性免疫中起着非常重要的作用,本试验以新西兰兔为材料,采用Case-Control试验设计,通过直接测序的方法寻找DEFB1、DEFB135、NP-5基因不同区域的突变位点,针对突变位点采用PCR-RFLP、HRM技术进行基因分型,分析以上基因遗传变异与新西兰兔非特异性消化道紊乱易感性间的关联性；根据防御素遗传变异与新西兰兔非特异性消化道紊乱易感性分析结果及突变位点的重要性筛选出DEFB135、NP-5基因,检测其肠道mRNA表达量。采用低纤维诱导新西兰兔发病,根据炎症的不同程度将低纤维群体分为健康组、轻微组和严重组,分析新西兰兔不同炎症程度下DEFB135、NP-5基因在回肠、结肠、圆小囊组织中mRNA表达量,分析不同基因型对NP-5基因表达量的影响。试图寻找与新西兰兔非特异性消化道紊乱性状关联的遗传标记,为新西兰兔的分子标记辅助选择和抗病育种提供依据。试验结果如下：1通过直接测序法寻找DEFB1基因外显子2、DEFB135基因、NP-5基因编码区多态,结果表明：在DEFB1基因外显子2上游20bp处存在T>G;DEFB135基因5’-UTR存在2个SNPs(c.-47T>A,c.-40C>A),3’-UTR存在1个SNP(c.*42C>G),且3个SNPs位点完全连锁；NP-5基因mRNA序列存在1个SNP r.154C>A,为非同义突变,导致p.Ala26Asp。2基于Case-Control试验设计,采用HRM技术对DEFB1、NP-5基因突变位点进行基因分型,结果表明：DEFB1基因外显子2上游20bp处T>G位点,T等位基因在Case-Control组的频率分别为66%和69%,说明T等位基因在两群体中处于优势地位,TT基因型(39%vs45%)、TG基因型(53%vs49%)、GG基因型(8%vs6%)在Case-Control组群体间差异不显著(P>0.05)。G等位基因的OR值为1.29(95%置信区间为：0.88-1.89,P=0.21),表明DEFB1外显子2上游20bp处T>G位点与新西兰兔非特异性消化道紊乱无显著关联。NP-5基因r.154C>A位点,A等位基因在Case-Control组的频率分别为：22%和33%,A等位基因在两群体间频率差异达到显著水平(P<0.05),A等位基因的OR值为0.577(95%置信区间为0.39-0.085,P=0.0046),AA基因型的OR为0.16(95%置信区间为0.06-0.43,P<0.0001),表明A等位基因和AA基因型能降低新西兰兔非特异性消化道紊乱易感性风险。采用PCR-RFLP技术对DEFB135基因c.-40C>A位点进行基因分型,结果表明：A等位基因在Case组和Control组比例相当,A等位基因的OR值为1.11(95%的置信区间为0.85-1.46,P=0.44),表明DEFB135c.-40C>A位点与新西兰兔非特异性消化道紊乱无显著关联。3三组织中,DEFB135基因表达量在结肠高于回肠和圆小囊,其中在圆小囊中的表达量最少；在回肠和结肠组织中随着炎症的加重DEFB135基因mRNA相对表达量呈下降趋势,在圆小囊中,轻微组的表达量显著低于严重组(P<0.05)。三组织中,NP-5基因在圆小囊中的表达量最高,结肠中的表达量最低；在结肠和圆小囊组织中,从不同炎症程度对表达量的影响来看,随着炎症的加重表达水平呈上升趋势,而在回肠组织中,严重组表达量低于轻微组而高于健康组,且三组织中不同炎症状态间表达量差异不显著(P>0.05);在回肠组织中AA型表达量极显著高于CC型(P<0.01)且显著高于CA型(P<0.05),在圆小囊组织中AA型表达量显著高于CC型(P<0.05);三组织中,能降低新西兰兔非特异性消化道紊乱易感性风险的AA基因型表达量最高,CA型次之,CC型的表达量最低。由此说明DEFB1基因外显子2上游20bp T>G位点、DEFB135基因(c.-47T>A, c.-40C>A, c.*42C>G)位点与新西兰兔非特异性消化道紊乱易感无显著关联,而NP-5基因r.154C>A位点与新西兰兔非特异性消化道紊乱易感关联,这为进一步研究NP-5基因在新西兰兔非特异性消化道紊乱机制的作用提供理论依据,为抗病育种奠定基础。
【关键词】 新西兰兔； α、β-防御素； SNP； 非特异性消化道紊乱；
1文献综述
1.1家兔非特异性消化道紊乱研究进展
我国是养兔大国，兔产业主要分布在四川、山东、福建、重庆、河北、河南、山西等地，家兔饲养量和兔产品产量均居世界首位，兔毛及兔肉出口量也居世界首位。兔肉被誉为“益智肉，保健肉，美容肉”，是因为其具有高蛋白、高氨基酸、高消化率和低胆固醇、低脂肪、低热量，赖氨酸、憐脂、妈、维生素的含量也很高，特别适宜老人、小孩食用。随着人们生活水平的提高，饮食爱好也有所偏向，兔肉越来越受到人们的青睐。因此规模化和集约化养兔也得到快速发展，但是家兔疾病尤其是家兔消化道紊乱制约着整个兔产业的发展。据有关资料显示，死亡家兔中因家兔消化道紊乱的比例占70%11]。
............................
1.2引起家兔非特异性消化道紊乱的原因
1.2.1病原微生物袭击
引起家兔消化道素乱的病原微生物很多，主要有细菌、病毒、真菌、寄生虫等。大肠杆菌，多杀性巴氏杆菌，沙门氏菌，魏氏梭菌等是主要的致病细菌，其中以大肠杆菌为首。曾有人在比利时和荷兰养兔场调查发现，21个兔场中存在粘附肠上皮并破坏微绒毛的大肠杆菌占70%17]。大肠杆菌在幼畜出生后，从口进入肠道，在肠道内大量繁殖。生产中大肠杆菌通常与其他病原菌混合感染发病，例如大肠杆菌与巴氏杆菌混合感染、与链球菌的混合感染19]、与球虫病的混合感染与沙门氏菌混合感染、与魏氏梭菌、沙门氏菌，球虫病的混合感染。
............................
2试验材料和方法
2.1试验材料
2.1.1试验动物的选择及样本的采集
(1) Case-Control群体的建立及样本的采集
Case-Control试验所用新西兰兔由四川成都市爱华畜牧科技有限公司种兔场提供，其营养水平和管理水平参考Zhangl56]等试验设计，试验期从28日龄断奶至84日龄，试验期间饲料营养水平和管理水平一致，且新西兰兔未服任何药品，每天仔细观察新西兰兔所有表现并详细记录。
将试验期间观察发现有拉稀，身体消瘦，腹部臌胀，排胶冻状或黑色水样排泄物，死后剖检发现十二指肠、空肠胀气或有积液，盲肠胀气，回肠、结肠内有胶冻物质，除此之外未发现其他疾病的新西兰兔归为Case组。而试验期间饮食正常且健康活拨无任何疾病的新西兰兔归为Control组。
....................
2.2试验方法
2.2.1试验样品的提取
2.2.1.1全基因组DNA提取
采取的耳组织样采用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒（AxyPrep? MuitisourceGenomic DNA Miniprep Kit)提取，按照动物组织中提取基因组DNA的步骤提取。试验前准备：先对所用器具、试剂、耗材进行消毒灭菌。按照试剂盒要求在去盐液中加入56 ml的无水乙醇并混合均匀；将蛋白酶K粉末溶解在蛋白酶K缓冲液中混合均匀（不能用漩祸振荡）；开启水浴锅，调至56°C，将eluent或去离子水放入水浴锅中加热，备用。
..........................
3 结果与分析 .....................28-43
3.1 基因组DNA提取结果 ...................28-29
3.2 总RNA提取结果 ......................29
3.3 DEFB1、DEFB135、NP-5基因Case-Control关联分析 .............29-36
3.3.1 DEFB1、DEFB135、NP-5基因PCR扩增及测序结果 ............29-31
3.3.2 DEFB1、DEFB135、NP-5基因分型结果 ............31-36
3.4 功能预测.............. 36-37
3.4.1 DEFB135基因5'-UTR功能预测 ...............36-37
3.4.2 NP-5基因蛋白功能预测 ...........37
3.5 肠道表达基因的筛选 ...........37
3.6 DEFB135、NP-5基因在不同组织中mRNA的表达 ..............37-43
3.6.1 DEFB135、NP-5基因荧光定量表达结果 ...........37-39
3.6.2 DEFB135基因在回肠、结肠、圆小囊组织中mRNA的表达............ 39-43
讨论
4.1 DEFBU DEFBI35、TV尸-5基因遗传变异分析
4.1.1DEFBI、DEFBI35、NP-5 基因 SNP 分析
本试验寻找新西兰兔DEFBI、DEFB135、NP-5基因SNP位点，结果发现DEFBI基因外显子2上游20 bp处存在1个SNP T>G; ￡>￡^別3?5基因存在3个SNPs位点(C.-47T>A, C.-40 OA, C.M2 OG),其中 c,47T>A, c,40 OA 在 Z)五基因 5’-UTR区，而c.*42C>G在3’-UTR区，通过直接测序的方法发现3个SNPs位点完全连锁，这有可能是家兔单一起源而导致DEFBI35遗传多样性比较低的主要原因。NP-5基因编码区存在1个SNP (r.l54 OA)。
..................................
结论
5.1 Z)￡/①7基因外显子2上游20 bp处存在1个SNPT〉G，Z)￡F573_5基因5’-UTR存在 2 个 SNPs (C.-47 T>A, c,40 OA)和 3’-UTR 存在 1 个 SNP (c.*42 C〉G)，三个SNPs位点完全连锁，NP-5基因mRNA存在1个SNPr.154 OA，为非同义突变。
5.2 DEFBI、D五基因SNP与新西兰兔非特异性消化道紊乱易感无显著关联，7VP-5基因r.]54 OA位点A等位基因对新西兰兔非特异性消化道素乱具有保护作用，AA型能降低新西兰兔非特异性消化道紊乱易感性风险。
5.3DEFB135基因mRNA表达量与新西兰兔NSDD相关。
5.4 NP-5基因mRNA表达量与新西兰兔NSDD可能相关，基因r. 154OA位点多态性与NP-5基因mRNA表达量显著相关。
..........................
参考文献:
本文编号：8862
【关键词】 新西兰兔； α、β-防御素； SNP； 非特异性消化道紊乱；
1文献综述
1.1家兔非特异性消化道紊乱研究进展
我国是养兔大国，兔产业主要分布在四川、山东、福建、重庆、河北、河南、山西等地，家兔饲养量和兔产品产量均居世界首位，兔毛及兔肉出口量也居世界首位。兔肉被誉为“益智肉，保健肉，美容肉”，是因为其具有高蛋白、高氨基酸、高消化率和低胆固醇、低脂肪、低热量，赖氨酸、憐脂、妈、维生素的含量也很高，特别适宜老人、小孩食用。随着人们生活水平的提高，饮食爱好也有所偏向，兔肉越来越受到人们的青睐。因此规模化和集约化养兔也得到快速发展，但是家兔疾病尤其是家兔消化道紊乱制约着整个兔产业的发展。据有关资料显示，死亡家兔中因家兔消化道紊乱的比例占70%11]。
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1.2引起家兔非特异性消化道紊乱的原因
1.2.1病原微生物袭击
引起家兔消化道素乱的病原微生物很多，主要有细菌、病毒、真菌、寄生虫等。大肠杆菌，多杀性巴氏杆菌，沙门氏菌，魏氏梭菌等是主要的致病细菌，其中以大肠杆菌为首。曾有人在比利时和荷兰养兔场调查发现，21个兔场中存在粘附肠上皮并破坏微绒毛的大肠杆菌占70%17]。大肠杆菌在幼畜出生后，从口进入肠道，在肠道内大量繁殖。生产中大肠杆菌通常与其他病原菌混合感染发病，例如大肠杆菌与巴氏杆菌混合感染、与链球菌的混合感染19]、与球虫病的混合感染与沙门氏菌混合感染、与魏氏梭菌、沙门氏菌，球虫病的混合感染。
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2试验材料和方法
2.1试验材料
2.1.1试验动物的选择及样本的采集
(1) Case-Control群体的建立及样本的采集
Case-Control试验所用新西兰兔由四川成都市爱华畜牧科技有限公司种兔场提供，其营养水平和管理水平参考Zhangl56]等试验设计，试验期从28日龄断奶至84日龄，试验期间饲料营养水平和管理水平一致，且新西兰兔未服任何药品，每天仔细观察新西兰兔所有表现并详细记录。
将试验期间观察发现有拉稀，身体消瘦，腹部臌胀，排胶冻状或黑色水样排泄物，死后剖检发现十二指肠、空肠胀气或有积液，盲肠胀气，回肠、结肠内有胶冻物质，除此之外未发现其他疾病的新西兰兔归为Case组。而试验期间饮食正常且健康活拨无任何疾病的新西兰兔归为Control组。
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2.2试验方法
2.2.1试验样品的提取
2.2.1.1全基因组DNA提取
采取的耳组织样采用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒（AxyPrep? MuitisourceGenomic DNA Miniprep Kit)提取，按照动物组织中提取基因组DNA的步骤提取。试验前准备：先对所用器具、试剂、耗材进行消毒灭菌。按照试剂盒要求在去盐液中加入56 ml的无水乙醇并混合均匀；将蛋白酶K粉末溶解在蛋白酶K缓冲液中混合均匀（不能用漩祸振荡）；开启水浴锅，调至56°C，将eluent或去离子水放入水浴锅中加热，备用。
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3 结果与分析 .....................28-43
3.1 基因组DNA提取结果 ...................28-29
3.2 总RNA提取结果 ......................29
3.3 DEFB1、DEFB135、NP-5基因Case-Control关联分析 .............29-36
3.3.1 DEFB1、DEFB135、NP-5基因PCR扩增及测序结果 ............29-31
3.3.2 DEFB1、DEFB135、NP-5基因分型结果 ............31-36
3.4 功能预测.............. 36-37
3.4.1 DEFB135基因5'-UTR功能预测 ...............36-37
3.4.2 NP-5基因蛋白功能预测 ...........37
3.5 肠道表达基因的筛选 ...........37
3.6 DEFB135、NP-5基因在不同组织中mRNA的表达 ..............37-43
3.6.1 DEFB135、NP-5基因荧光定量表达结果 ...........37-39
3.6.2 DEFB135基因在回肠、结肠、圆小囊组织中mRNA的表达............ 39-43
讨论
4.1 DEFBU DEFBI35、TV尸-5基因遗传变异分析
4.1.1DEFBI、DEFBI35、NP-5 基因 SNP 分析
本试验寻找新西兰兔DEFBI、DEFB135、NP-5基因SNP位点，结果发现DEFBI基因外显子2上游20 bp处存在1个SNP T>G; ￡>￡^別3?5基因存在3个SNPs位点(C.-47T>A, C.-40 OA, C.M2 OG),其中 c,47T>A, c,40 OA 在 Z)五基因 5’-UTR区，而c.*42C>G在3’-UTR区，通过直接测序的方法发现3个SNPs位点完全连锁，这有可能是家兔单一起源而导致DEFBI35遗传多样性比较低的主要原因。NP-5基因编码区存在1个SNP (r.l54 OA)。
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结论
5.1 Z)￡/①7基因外显子2上游20 bp处存在1个SNPT〉G，Z)￡F573_5基因5’-UTR存在 2 个 SNPs (C.-47 T>A, c,40 OA)和 3’-UTR 存在 1 个 SNP (c.*42 C〉G)，三个SNPs位点完全连锁，NP-5基因mRNA存在1个SNPr.154 OA，为非同义突变。
5.2 DEFBI、D五基因SNP与新西兰兔非特异性消化道紊乱易感无显著关联，7VP-5基因r.]54 OA位点A等位基因对新西兰兔非特异性消化道素乱具有保护作用，AA型能降低新西兰兔非特异性消化道紊乱易感性风险。
5.3DEFB135基因mRNA表达量与新西兰兔NSDD相关。
5.4 NP-5基因mRNA表达量与新西兰兔NSDD可能相关，基因r. 154OA位点多态性与NP-5基因mRNA表达量显著相关。
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参考文献:
- [1] 杨玉荣,刘占举,梁宏德. 防御素在炎症性肠病中的作用机制[J]. 世界华人消化杂志. 2010(29)
- [2] 吴小平,欧阳春晖. 防御素与炎症性肠病[J]. 世界华人消化杂志. 2008(28)
- [3] 佘锐萍,李冰玲,刘伟,刘玉如. 兔圆小囊及肠道组织中抗菌肽的免疫组织化学和免疫电镜细胞化学定位[J]. 中国兽医科学. 2008(03)
- [4] 李华慧,莫永玉. 兔大肠杆菌与球虫病并发症的诊治[J]. 中国畜牧兽医. 2007(01)
- [5] 祝秉东,冯云,黄宁,吴琦,王伯瑶. 卡介苗增强人肺腺上皮细胞β-防御素-1基因的转录(英文)[J]. Acta Pharmacologica Sinica. 2003(09)
- [6] 贾建军,王卫红,张玲,孟丹,杨正玉,程洁. 兔大肠杆菌和巴氏杆菌混合感染的诊断[J]. 吉林畜牧兽医. 2003(07)
- [7] 余锐萍,刘玉如,宋俊霞,刘海虹,刘环,李冰玲,贾君镇. 兔圆小囊淋巴组织中神经内分泌细胞[J]. 科学技术与工程. 2003(03)
- [8] 谷子林,霍贵成,张玉华,李江. 日粮粗纤维及对家兔的生理功能[J]. 饲料工业. 2002(11)
- [9] 程菊芬. 魏氏梭菌、大肠杆菌混合感染引起家兔腹泻病的诊治[J]. 浙江畜牧兽医. 2001(01)
- [10] 梁发旺,黎美姜. 兔链球菌及大肠杆菌混合感染的诊治[J]. 广西畜牧兽医. 1999(04)
本文编号：8862
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