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斑马鱼胆碱能受体受神经抑制类农药的影响研究

发布时间：2014-09-20 20:45

【摘要】 有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药以及拟除虫菊酯类农药，都因其高效、低毒、低残留的特点而广泛应用于农业、林业和卫生等行业。这三类农药都能影响动物神经系统的传导，进而产生相应的神经毒性作用，因此可以统称为神经抑制类农药。目前许多研究发现，有机磷农药主要是通过抑制乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase, AChE）活性而发挥毒性作用的，此外有机磷农药还可能直接抑制毒蕈碱型乙酰胆碱受体（Muscarinic acetylcholinereceptor, mAChR）和烟碱型乙酰胆碱受体（Nicotinic acetylcholine receptor, nAChR）的活性；氨基甲酸酯类农药具有与有机磷类农药类似的抑制作用，也是主要抑制AChE的活性；拟除虫菊酯类农药则主要是通过抑制动物神经细胞膜上的Na+通道，使神经系统的传导失常，从而产生神经毒害作用。斑马鱼(Danio rerio)具有个体小、繁殖力强、易操作、对毒物反应敏感等特点，是研究脊椎动物毒性作用的理想生物模型。本文选用了有机磷类农药马拉硫磷、氨基甲酸酯类农药灭多威以及拟除虫菊酯类农药溴氰菊酯作为实验药物，以斑马鱼成体为受试生物，根据三种农药对斑马鱼的24h半数死亡浓度（24h-LC50），设定0.5TU、1TU和2TU三个浓度组，测定不同农药不同浓度下，mAChR和nAChR的活性随时间的变化趋势，以分析斑马鱼体内这两种受体活性的变化规律。为进一步探讨神经抑制类农药对胆碱能系统的作用机制和胆碱能受体活性的影响提供数据支持。研究结果表明：1.24h急性毒性实验表明：马拉硫磷、灭多威和溴氰菊酯对斑马鱼的24h-LC50分别9.48μg/L、2299.23μg/L、5.32μg/L，马拉硫磷和溴氰菊酯对于斑马鱼属于剧毒性毒物，而灭多威属于中等毒性毒物。斑马鱼的死亡率与这三种农药的浓度均呈正相关，具有较高的相关系数，且具有明显的剂效关系。在行为上，斑马鱼在受到不同药物的刺激时，均会表现出明显的行为变化，这是斑马鱼对毒物环境的调整和适应。2.马拉硫磷、灭多威和溴氰菊酯对斑马鱼的毒蕈碱型乙酰胆碱受体有明显地抑制效果。其中，灭多威对mAChR的抑制作用最大；而差异性实验表明，在低浓度（0.5TU）下，溴氰菊酯的抑制作用最显著。随着暴露时间的增加，各浓度组的mAChR活性均出现降低的现象，且基本上符合随着暴露浓度的增加，抑制效果越明显的趋势。在暴露过程中，有时会出现活性回升的现象，可能与斑马鱼对毒物环境的适应有关。3.马拉硫磷、灭多威和溴氰菊酯对斑马鱼的烟碱型乙酰胆碱受体存在一定的抑制作用，但总体来说，抑制效果不如对mAChR明显。溴氰菊酯对nAChR活性的抑制效果最明显，达到39.88%。而差异性分析表明，仅马拉硫磷在0.5TU浓度下存在显著性地抑制效果。nAChR的活性随暴露时间的延长而降低的现象并不明显，大部分浓度下，在暴露前期就存在抑制效果，且一直保持在一定的范围内，说明农药对nAChR活性的影响有一定的限制作用。在某些时间也会出现nAChR活性恢复的现象，可能与斑马鱼对农药代谢的适应有关。4. mAChR和nAChR的活性随时间的变化趋势与生物逐级行为模型(Stepwise stressmodel, SSM)有一定的相似性。多数暴露组浓度存在暴露前期活性增强，之后活性降低的现象；而且出现活性降低过程中活性回复的阶段。综上所述，三种农药对mAChR和nAChR均存在一定的抑制作用，其中对mAChR活性的抑制效果明显，这可能与农药的制度机制有关。在低药物浓度下，mAChR的活性对溴氰菊酯较为敏感，而nAChR的活性对马拉硫磷较为敏感。总体而言，胆碱能受体的抑制作用与农药的暴露浓度和暴露时间均存在正相关。在一定时间存在活性恢复的现象，这应该与斑马鱼对药物的适应有关。 

【关键词】 斑马鱼； 神经毒性； 半致死浓度； 毒蕈碱型乙酰胆碱受体； 烟碱型乙酰胆碱受体； 

1 文献综述

1.1 农药及其污染
农药作为一类毒性较高且不易分解的化学品，在使用后很容易通过地表径流、雨水冲刷和渗透等方式进入水环境中并造成水体污染[2]。随着工农业的快速发展和农药的大量使用，农药污染问题已然成为一项突出的环境污染问题。根据联合国粮农组织的报告，全世界每年约发生 100~500 万起农药中毒事件。在我国，农药每年的使用量达 50 万~60 万 t，而这些农药被植物体或动物体截留的不足 20%，有 80%以上的农药在使用后是直接进入环境的[3]。而根据国家统计局发布的相关数据，2009 年中国农药的产量为 190 万 t，2010 年则到达 240 万 t，产量和增幅均居世界首位。长期并大量地使用农药，不仅会直接严重污染环境，也会使残留的部分通过食物链达到生物富集，进而对动物和人类产生毒性。

1.2 受试农药
20 世纪 30 年代，德国人施拉德(G• Schrader)领导的研究小组在化学合成的一系列化合物中发现了一些有机磷酸酯类具有杀虫作用，此后有机磷农药(OPPs)开始生产和发展起来。1943 年生产出了第一个商品化的有机磷杀虫剂特普(TEPP，焦磷酸四乙酯)，主要用于害虫防治；1944 年有机磷杀虫剂对硫磷(Parathion)开始大量生产；同时一些低毒品种，如乐果、马拉硫磷、敌百虫和杀螟松等也开始广泛用于农业害虫、卫生害虫、家畜害虫等的防治。到 2000 年有机磷类杀虫剂已占总杀虫剂的 1/3[4]。到目前为止，许多有机磷农药品种仍在全球的动植物保护中发挥着重要作用，而且很多有机磷品种成为农药的骨干品种，如草甘膦，已成为全球销售额最高的农药品种。
............

2 马拉硫磷、灭多威和溴氰菊酯对斑马鱼的急性毒性作用

本部分实验分别测定了在马拉硫磷、灭多威和溴氰菊酯暴露下斑马鱼的 24 h 半致死浓度(50% Lethal Concentration in 24h，24 h-LC50)，以便在后续研究中实现各种农药毒性浓度的统一。

2.1 材料与方法
斑马鱼(Danio rerio)，由山东师范大学生命科学学院繁育，斑马鱼成体长(3.0±0.2) cm，体重( 0.3±0.05) g，培养方式为流水培养，水温： 26±2 ℃，光照周期为 16 h（明）：8 h（暗），早晚定时投喂干饲料 2 次，并清除排泄物。本实验采用体长 3.0±0.2 cm 的健康斑马鱼，采用随机取样法取样。分别选用了有机磷类农药马拉硫磷（纯度 99%）、氨基甲酸酯类农药灭多威（纯度 99%）和拟除虫菊酯类农药溴氰菊酯（纯度 98.2%）作为试验药物，药品标准样均购于中国标准样品中心。马拉硫磷直接溶于 pH 5.0 的去离子水中，灭多威溶于 pH 7.0 的去离子水中，溴氰菊酯溶于≤0.5%总水体积的二甲基亚砜(DMSO)中，pH 7.0。

2.2 结果与分析
从 3 种农药对斑马鱼的急性毒性来看，斑马鱼对不同农药有不同的耐受性。其中，马拉硫磷和溴氰菊酯对于斑马鱼属于剧毒性毒物，而灭多威对于斑马鱼属于中等毒性毒物。不同农药对斑马鱼毒性大小的不同，可能是因为不同农药的毒性机理不同。有机磷类农药马拉硫磷和氨基甲酸酯类农药灭多威的主要致毒机理都是通过与生物体内的胆碱酯酶结合形成磷酸化的胆碱酯酶，从而抑制胆碱酯酶催化胆碱的水解过程，导致乙酰胆碱等信号分子的代谢紊乱，并使得 mAChR 和 nAChR 发生自适应改变，从而产生神经中毒；区别在于马拉硫磷与胆碱酯酶结合形成的磷酸化复合物非常稳定且不可逆，马拉硫磷还可以直接抑制 mAChR 和 nAChR 的活性，而灭多威与胆碱酯酶的结合反应是可逆的[68]。拟除虫菊酯类农药溴氰菊酯作为一种高毒性的杀虫剂[69]，主要通过干扰突触膜上的 Na+通道，使神经系统的传导失常，从而产生强烈的毒害作用[70]。在急性毒性实验期间，对照组的斑马鱼运动正常，实验组的斑马鱼由于受药物的毒性作用而出现游动幅度变大、呼吸加快、腮部变红、排泄物变多等神经兴奋行为，这可能是斑马鱼产生的一种回避行为反应[71]。

3 马拉硫磷、灭多威、溴氰菊酯对斑马鱼毒蕈碱型乙酰胆碱受体的影响...........................19
3.1 实验................19
3.2 材料与方法......................................19
3.2.1 药品器材................................19
4 马拉硫磷、灭多威、溴氰菊酯对斑马鱼烟碱型乙酰胆碱受体活性的影响.......................28
4.1 实验目的.....................................28
4.2 材料与方法........................28 
5 结论................................................35

4 马拉硫磷、灭多威、溴氰菊酯对斑马鱼烟碱型乙酰胆碱受体活性的影响

4.1 实验目的
分别设定 0.5 TU、1 TU、2 TU 和对照组，研究不同污染物对斑马鱼 N 型受体的影响，以分子水平研究不同农药对斑马鱼胆碱能系统的影响。

4.2 材料与方法
马拉硫磷、灭多威、溴氰菊酯，购于国家标准样品中心；牛血清蛋白(BSA)、考马斯亮蓝，SBH-Bio 公司；二甲基亚砜(DMSO)，Biosharp 公司；NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、乙醇，分析纯，国药集团；斑马鱼烟碱型乙酰胆碱受体酶联免疫分析(Elisa)试剂盒。超声波破碎仪，BILON-650Y，上海比朗仪器有限公司；酶标仪、高速离心机、分光光度计、恒温干燥机、电子天平、恒温水浴锅等。将斑马鱼暴露于 0 TU、0.5 TU、1 TU 和 2 TU 的不同农药中，每 1 h 取样 1 次，连续取样 12 h 或至斑马鱼全部死亡。如果实验组中每 1 h 内有斑马鱼死亡，则另外取样。样品分别装入 EP 管，于-80 ℃冰箱中保存
将-80 ℃冰箱中的样品，加入 9 倍体积的预冷的 PBS(0.1 M，pH 7.2)，迅速用超声波破碎仪破碎，破碎完成后装入离心管，在 4 ℃、2,500 rpm/min 下离心 25 min，取上清液作为粗蛋白液。以 BSA 为参照，通过 Bradford 法[72-74]测定蛋白含量，将蛋白液浓度确定为 0.5mg/ml。具体测量方法见表 3-1。
用双抗体夹心法测定斑马鱼体内nAChR 的活性。用纯化的 nAChR 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 nAChR 标准品和样品蛋白。辣根过氧化物酶(HRP)标记的 nAChR 抗体结合，并形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加HPR 底物四甲基联苯胺(TMB)显色。TMB 在 HRP 的催化下转化成蓝色，并在酸性作用下转化成黄色，颜色的深浅与样品中 nAChR 的浓度呈正相关。

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5 结论

本论文选用广泛应用于工农林生产中的有机磷类农药马拉硫磷、氨基甲酸酯类农药灭多威和拟除虫菊酯类农药溴氰菊酯，这三种神经抑制类农药作为受试药物，以斑马鱼(Danio rerio)作为模式生物进行毒性效应研究。研究不同时间不同农药暴露下斑马鱼的mAChR 和 nAChR 活性变化规律，得出以下结论：1. 24 h 急性毒性实验表明：3 种农药对斑马鱼的毒性存在差异，毒性大小依次是，溴氰菊酯＞马拉硫磷＞灭多威。马拉硫磷、灭多威和溴氰菊酯对斑马鱼的 24 h-LC50 分别 9.48μg/L、2299.23 μg/L、5.32 μg/L。对于斑马鱼来说，马拉硫磷和溴氰菊酯属于剧毒性毒物，而灭多威属于中等毒性毒物。斑马鱼的死亡率与这三种农药的浓度均呈正相关，具有较高的相关系数，且具有明显的剂量—效应关系(Dose-effect relationship)。斑马鱼在受到不同毒物的刺激时，均会表现出明显的行为变化，这与斑马鱼在毒物条件下的适应相关。
...............

参考文献:



本文编号：9103

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