基于疏肝通窍法对青光眼视网膜神经节细胞保护通路激活的研究

【摘要】 目的：探讨临床中自拟方通窍明目4号对青光眼性视神经损伤的保护作用及分子学作用机制,为中药方剂对神经元保护提供直接证据。材料和方法：腹腔注射10%水合氯醛(3.8ml/kg)麻醉小鼠,并辅以0.4%盐酸奥布卡因滴眼液局部麻醉,并用复方托比卡胺眼药水术眼散瞳。采用单侧前房注射复方卡波姆溶液的方法在成年SD大鼠上建立慢性高眼压模型。造模成功后,对高眼压—周的大鼠模型,给予通窍明目4号按照低剂量、中剂量、高剂量进行治疗两周,并用维生素B1、B12作为西药对照组治疗。以大鼠慢性高眼压模型视网膜内信号传导与转录激活因子3(stat3)、视网膜神经节细胞、视网膜抗凋亡基因(Bcl-x1)为干预靶点,采用免疫组织化学、免疫印迹、病理组织学观察和细胞超微结构检测等方法,从整体及细胞、基因等多个层次系统地研究通窍明目4号对青光眼的视神经保护作用及分子学作用机制,定量分析比较通窍明目4号的视神经保护作用。两组之间采用独立样本t检验,多组之间比较采用单因素方差分析,p<0.05被认为有差异性,具有统计学意义,p<0.01为具有及其显著的差异性。结果：1.光镜下空白组视网膜十层结构清晰,视网膜神经节细胞清晰可见,无水肿。高眼压后的视网膜早期变厚晚期变薄,隔层结构不清,排列紊乱,空泡状结构增多,节细胞数量减少,炎细胞浸润。经过通窍明目4号治疗后的视网膜损伤明显轻于模型组,视网膜各层结构稍紊乱,节细胞排列松散,可见空泡样变,节细胞数量较模型组增多,网膜病变程度减轻。2.电镜下空白组节细胞及神经胶质细胞结构正常,视细胞内节中线粒体丰富,外节形态结构正常,膜盘排列紧密。高眼压模型节细胞结构模糊,细胞器消失,线粒体肿胀,胞浆空泡变性,突触融合,膜盘溶解。经过药物治疗后空泡变性数量较模型组减少,节细胞膜清晰,胞浆内可见结构基本正常的粗面内质网、线粒体。用药后线粒体水肿减轻,突触结构相对清晰,膜盘融合程度减轻。3.免疫组化及免疫印迹提示：空白组的大鼠视网膜stat3、 Bcl-x1呈低表达,高眼压模型呈现出1W表达轻度上升,3W则表达回落,而经过药物治疗后,表达则明显上升,提示通窍明目4号激活了视神经保护通道。结论：通窍明目4号可以减轻高眼压造成的视网膜病理改变,纠正可逆的变性细胞,减轻高眼压状态下RGCs的凋亡,激活stat3神经通路,上调抗凋亡基因,发挥神经保护作用,这条通路通过整合包括诱导和调节免疫反应,DNA修复、线粒体的修复在内的多种方式发挥作用。因此通窍明目4号对青光眼性视神经、视网膜的损伤有修复作用,改善RGCs的生存微环境,保护未受损的细胞,延缓或阻止部分损伤的细胞继续变性。 

前言

寻找理想的慢性高眼压模型一直是研究青光眼发病机制和视神经保护机制的难点，常规的造模方法如巩膜上静脉结扎或烧灼、激光光凝小梁网等均未能形成理想的慢性高眼压模型，本研究在前期研究的基础上，成功创造了新的慢性高眼压动物模型。中医药在治疗青光眼性视神经萎缩方面有着独特的优势，但是中医药在基础领域的研究比较匮乏，中医药对青光眼的视神经保护作用机制和有效性，迫切需要基础研究做理论支撑。以“疏肝通奇”为立方原则的通穷明目4号，是导师孙河教授多年应用于临床治疗的经验方，前期临床研究表明其对改善视力，视野、VEP等指标有着明确的疗效，本课题以通宵明目4号为干预手段，以大鼠慢性高眼压模型视网膜内转录信号转导和激活因子3(stat3)通路、视网膜神经节细胞（RGCs)、视网膜抗凋亡基因（bcl-xl)为干预紀点，采用病理组织学观察、免疫组织化学、免疫印迹和细胞超微结构检测等方法，从整体及细胞、基因等多个层次系统地研究疏肝通鸾法对青光眼的视神经保护作用及分子学作用机制，从而为中药方剂对青光眼视神经保护作用的有效性提供依据，为中药方剂在国际市场的推广和应用铺平道路。
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文献综述

1. 青光眼视神经损害的发病机理
眼内压的异常升高是导致青光眼发病的重要原因[3’ 4]，眼压升高导致蹄板各层变形且移位，挤压从蹄孔通过的神经纤维，导致视神经细胞的轴衆运输阻滞于筛板区域，轴菜膜不能利用线粒体产生的ATP，导致各种神经营养因子及保护蛋白的生成和转运减少，导致细胞代谢障碍而死亡6]。但是，眼正并不是青光眼疾病的唯一发病因素[7]，临床病例中，有部分患者虽然眼压超出正常范围，但是却没有出现青光眼的视神经损害和视野缺损；还有部分患者眼压虽然在正常范围内，但是却具有典型的青光眼损害体征；还有部分青光眼患者经过药物或是手术和激光治疗，眼压控制在正常范围内，但是视神经和视野损害仍在继续。因此，机械学说不是青光眼发病的唯一机制。

2血流学说
眼球的血液供应由视网膜中央血管系统和睫状血管系统组成。研究…⑴发现青光眼患者视神经动脉血流供应量下降，血流的阻力指数增大，并且出现血管痉挛，视网膜、视盘血管变异等病变，病变导致视乳头的有效灌注压下降，引发了视网膜的缺血、缺氧，线粒体产生的ATP减少，Na+/K+-ATP酶失活，大量Ca2+内流，导致Ca2+超载，并产生了大量的氧自由基和脂质过氧化物，对神经元产生了毒性作用；同时，缺氧导致了大量的兴奋性谷氨酸的被释放，使NMDA等受体活化，启动了 RGCs的凋亡程序，导致视神经纤维轴衆流中断，导致靴源性神经营养因子供给中断，RGCs调亡研究发现，青光眼患者的血管疫挛发病率明显高于正常人群，其对闪光点的血管反应比常人明显下降[i4],反复的闪光点刺激可以改善青光眼患者的血管反应，提示青光眼患者血管模式的变化。血管疫挛致使血管阻力升高，使眼部组织血流量降低，进而造成青光眼视神经损伤。
近期，研究人员通过前房注射微球诱发小鼠高眼压的模型，该模型通过微球颗粒在房角边集阻塞房角，导致房水回流易度加大，使眼压逐渐升高。市场上可以买到多种直径的微球，可根据实验动物和实验要求，选择合适的直径微球。该研究者使用了直径15微米微球进行注射，研究结论认为15微米微球可以成功诱导慢性高眼压，且造成青光眼视神经病变的出现。其模型高眼压约持续3周，最高眼伍为22.1 土 0.5mmHg,相对于基础眼压9.5±0. 5mtnHg，升高了约12 mniHg，但整体来看眼压升高幅度不理想。研究证明注射微球的数量同眼压升高旳程度和持续的时间成正比，并且发现注射微球诱发的高眼压模型，高眼压状态大约维持3周，3周后又恢复到正常水平，因此需要再次注射微球来维持高眼压状态"5’ 16]，而这样容易引起眼球感染。

第一部分复方卡波姆前房注射诱导SD大鼠慢性高眼压模型的建立 ...........19
1.材料和方法.............19
2.结果....................24
3讨论..........................27
第二部分基于疏肝通窍法对青光眼视网膜神经节细胞保护通路激活的研究 .................32
1.材料和方法.................32
2.结果...............42
3讨论..................47
结论...........................64

第二部分基于疏肝通穷法对青光眼视网膜神经节细胞保护通路激活的研究

1.材料和方法
本实验采用北京维通利华实验动物技术有限公司的成年SD (SPF级）大鼠140只（实验动物许可证号：SCXK-(京）2012-0001))，鼠龄在8周到12周之间，体重200土 12.09g,雌雄各半，雌鼠与雌鼠同笼，雄鼠与雄鼠同笼。实验室选择在黑龙江中医药大学药物安全评价中心实验室，该实验室是屏障环境实验室，实验动物使用许可证号：SYXK黑2008001。饲养大鼠的笼子为专用笼，具有专门的粪便及垃圾存放盒。饲养室装备自动照明装置，为白天12小时黑夜12小时的定时周期循环。鼠笼内配有自动饮食、饮水装置。动物的饲养和操作均遵循美国视觉和眼科研究学会(Association for Research in Vision and Ophthalmology, ARVO)和黑龙江中医药大学制定的科研动物和实验室使用规范。

2结果
先将甲液充分搅拌溶解，然后将硫酸银钾加入蒸馈水中溶解，并且加热使其充分溶解，然后将两种液体混合充分，’然后煮沸，停止加热后，慢慢加入氧化萊，冷却后过滤，慢慢加入冰醋酸数滴。清洁级SD (SPF级）大鼠140只，雌雄各半，体重200±12.09g，适应性驯养一周。实验室选择在黑龙江中医药大学药物安全评价中心实验室，该实验室是屏障环境实验室，实验动物使用许可证号：SYXK黑2008001。实验动物购置北京维通利华实验动物有限公司，为SD大鼠SPF级，动物许可证号：SCXK(京）2012-0001。饲养室自动照明装置实现12小时白天12小时黑夜的定时周期循环（照明装置于早上6点钟自动开启）。造模前，测量所有大鼠眼压，将大鼠眼￡11超出10-21mmHg范围内或是大于等于对侧眼5mmHg剔除，并补充符合条件的大鼠。造模方法同第一部分。
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结 论

1.复方卡波姆溶液前房注射构建大鼠模型，眼压升高达标，持续时间长，不良反应少；视神经、视网膜病理损伤表现典型。成功构建大鼠慢性高眼压模型。2首次发现青光眼视神经损害机制与Stat3密切相关，发生高眼压时Stat3表达升高，发挥保护作用，随高眼压时间推移Stat3表达下降，甚至灭活，表明自身的保护机制的短暂性和有限性，及时的视神经保护不可或缺。3.通穷明目4号激活了 St at 3信号通道，使St at 3活化为p- stat3,完成了 JAK-stat3的信号通路激活过程，上调了 bcl-XI，有效地保护了高眼压下的视神经。同时再次证明了没有STAT3的激活，神经元对外界剌激十分敏感，会迅速发生凋亡。4.通穷明目4号改善了视网膜神经节细胞生存的微环境，保护未受损的神经节细胞，修复受损神经节细胞，阻止神经节细胞调亡，减轻了高眼压状态下RGCs的凋亡，纠正可逆的变性细胞，使受损的视网膜全层得到改善，并且高剂量的修复作用明显优于中、低剂量。

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