吉林省四平市儿科抗生素应用状况调查及葡萄球菌耐药性研究

【摘要】 抗生素是人类在医药领域取得的最伟大成就之一,对人类健康水平的提高和生命安全的保障起到了极其重要的作用。然而,目前国内外抗生素滥用的问题十分突出,导致耐药菌急剧增多,药害事件不断发生,对处于生长发育时期的儿童影响尤为突出。四平市妇婴医院是四平市唯一儿童专科医院,其抗生素应用情况具有代表性,并且呼吸系统感染是儿童常见病和多发病,也是抗生素应用频率高、种类多的疾病,因此我们对四平市妇婴医院2002-2005年呼吸系统感染住院儿童抗生素应用状况进行流行病学调查分析,以明确该地区抗生素使用不合理的原因和环节;同时对四平市妇婴医院2004年12月至2005年6月期间呼吸系统感染患儿葡萄球菌的检出率及耐药性进行研究,运用EXCEL软件对上述数据进行统计学处理,分析未应用抗生素及应用抗生素两组葡萄球菌的检出率及耐药性是否存在差异,绘制两组葡萄球菌的耐药趋势图,为儿科细菌耐药性研究提供依据,为临床合理使用抗生素提供参考;并用分子生物学方法分析葡萄球菌耐药的遗传机制,为四平地区呼吸系统感染儿童所携带的葡萄球菌的分子流行病学研究提供资料。本论文的主要内容包括:1.2002-2005年四平市妇婴医院儿科呼吸道感染抗生素应用状况调查及分析2.抗生素应用对葡萄球菌耐药性的影响3.Sul1及aph(3’)-III基因的检测 

第一篇 2002－2005年四平市妇婴医院儿科呼吸道感染抗生素应用状况调查及分析 

在我国，小儿呼吸道感染是儿科常见病和多发病，且抗生素的使用率极高，为明确四平地区儿科呼吸道感染疾病抗生素的应用现状及存在的问题,对2002年1月至2005年12月四平地区呼吸科住院儿童抗生素应用情况作回顾性调查分析。 

一、资料与方法 

1．资料 分别随机抽取2002、2003、2004、2005年呼吸科住院儿童病例各300份。 

2．方法 统计抗生素应用种类、应用频率、用药总量、实际用药天数、约定日剂量（DDD）、药物利用指数（DUI）、平均住院天数、抗生素的联合应用情况、细菌检测及药敏试验结果。约定日剂量（define daily dose，DDD）是WHO药物利用研究组推荐的测定药物利用的单位，DDD值由《儿科临床药物手册》常用日剂量确定，DDDs（总DDD数）=用药总量/该药的DDD值，DUI是Ghodse教授提出的药物利用指数（drug utilization index，DUI），DUI≤1即为合理，DUI=DDDs/实际用药天数。根据上述数据分析抗生素应用的状况、趋势及合理性。 

二、结果 

1．2002－2005年四平地区呼吸科住院儿童抗生素应用率均为100％。 

2．2002－2005 年抗生素应用种类、应用频率、用药总量、实际用药天数、约定日剂量（DDD）、药物利用指数（DUI）分别见表1、2、3、4。 

3．2002－2005 年四平地区呼吸科住院儿童抗生素应用频率的分布：见图 1、2、3、4。 

4．2002－2005年四平地区呼吸科住院儿童抗生素应用状况的对比分析（见表和图5）：近四年，该地区青霉素类抗生素的应用率低，并呈逐年下降趋势；青霉素/酶抑制剂类抗生素在 2003 年开始应用，应用率逐年降低；四年间，头孢一代抗生素的应用率均最低；头孢三代抗生素的应用频率均稳居首位，且远高于其他常用抗生素，头孢二代抗生素的应用率均处于第二位，且应用率较稳定；随着 2004 年头孢三代/酶抑制剂投入该地区儿科临床，头孢三代抗生素的使用率呈现逐年增长的趋势。 

5．平均住院天数及抗生素的联合应用状况：2002年四平地区呼吸科住院儿童平均住院天数7.09d，最少2d，最多15d，单用一种抗生素219例，占 73％，住院期间联合或先后应用两种抗生素54例，占 18％，三种抗生素 24 例，占 8％，四种抗生素 3 例，占 1％；2003年平均住院天数5.2d，最少2d，最多15d，单用一种抗生素219例，占73％，住院期间联合或先后应用两种抗生素72例，占24％，三种抗生素9例，占3％；2004年平均住院天数4.11d，最少 2d，最多 13d，单用一种抗生素 237 例，占 79％，两种抗生素51 例，占 17％，三种抗生素 12 例，占 4％；2005 年平均住院天数6.2d，最少2d，最多16d，单用一种抗生素195例，占65％，两种抗生素 75 例，占 25％，三种抗生素 21 例，占 7％，四种抗生素3例，占1％，五种抗生素6例，占2％。

6．细菌检测及药敏试验结果：调查2002－2005年的1200份呼吸科住院儿童病例均未提检病原体及药敏试验报告单。 

第二篇   抗生素应用对葡萄球菌耐药性的影响  

为深入了解儿科抗生素的应用对葡萄球菌耐药性的影响，对四平市妇婴医院2004年12月至2005年6月期间呼吸系统感染患儿葡萄球菌的检出率及耐药性进行调查研究，运用 EXCEL 软件对上述数据进行统计学处理，分析未应用抗生素及应用抗生素两组葡萄球菌的检出率及耐药性是否存在差异，绘制两组葡萄球菌的耐药趋势图，为儿科细菌耐药性研究提供依据，同时为临床儿科正确使用抗生素提供第一手资料。 

一、材料及方法 

（一）标本的来源     

四平市妇婴医院2004年12月至2005年6月期间呼吸系统感染，但尚未应用抗生素的门诊患儿的标本 250 例，上述时间内，呼吸科住院并应用抗生素治疗达三天以上的患儿390例。 

（二）标本采集、菌株分离、鉴定及药敏试验 

1.培养基：普通营养肉汤、普通营养琼脂、M-H琼脂等均购自杭州天和生物制品公司。 

2.生化试剂：甘露醇发酵管购自杭州天和生物制品公司，兔血浆由本室制备。 

3.主要实验仪器： SW-CJ-IF净化工作台  苏州集团苏州安泰空气技术有限公司 显微镜 Nikon ALPHAPHOT-2 YS2 中国 ES-60J电子分析天平      沈阳龙腾电子称量仪器有限公司 电热恒温培养箱 HG303-5                南京实验仪器厂 

4.药敏纸片：青霉素 G、苯唑西林、氨苄西林/舒巴坦钠、头孢唑林、头孢呋辛、头孢哌酮、克林霉素、红霉素、万古霉素、庆大霉素、环丙沙星、四环素、新诺明，购自杭州天和生物制品公司。 

5.质控菌：金黄色葡萄球菌ATCC25923 

6.标本采集 （1）咽拭子：消毒棉签适度用力擦拭咽后壁和扁桃体部位，然后迅速放入内装3－5毫升无菌运送液的试管中（运送液为无菌的普通营养肉汤），在靠近顶端处折断棉签杆，塞紧瓶塞。 

（2）菌株分离及鉴定 将所取标本划线接种于普通营养琼脂平板上，37℃培养 18－24 小时，挑取单个可疑菌落革兰氏染色，然后接种于甘露醇发酵管，最后结合血浆凝固酶试验将其鉴定至凝固酶阴性及阳性葡萄球菌。 

（3）药敏试验：具体方法及结果判定严格参照美国临床实验标准委员会（NCCLS）1999年制定的《药片法抗菌药物敏感试验操作方法》。方法：用接种环挑取4－5个菌落接种于肉汤培养基中，置37℃培养4－6小时，然后用生理盐水稀释培养液，使其浊度至0.5号麦氏比浊管，充分混匀后用无菌棉签蘸取上述肉汤培养基，在管壁上挤压，去除多余的液体，均匀涂于 M-H 琼脂平板表面，在室温下干燥 5 分钟，用无菌镊子以无菌操作取出含药纸片贴在涂有细菌的平板上，轻轻按压，以保证纸片与培养基牢固接触，将平皿置37℃恒温箱培养16－18小时。结果判定：观察药敏纸片周围有无抑菌环，量取其直径（包括纸片直径）大小，用毫米数记录，按抑菌环直径的大小报告敏感、中度敏感和耐药。 

二、结果与分析 

1.未应用抗生素组250例检出葡萄球菌49株，检出率19.6％，金黄色葡萄球菌17株（17/49，34.69％），其中MRSA16株（16/49，32.65％）；凝固酶阴性葡萄球菌 32 株（32/49，65.31％），均为MRCNS（32/49，65.31％）。应用抗生素组 390 例检出葡萄球菌 83株，检出率 21.28％，金黄色葡萄球菌 7 株（7/83，8.43％），均为MRSA（7/83，8.43％）；凝固酶阴性葡萄球菌 76株（76/83，91.57％），其中 MRCNS70 株（70/83，84.34％）。经统计学处理，两组菌株葡萄球菌、MRSA与MRCNS的分离率无显著差异（P＞0.05）。 

2.两组菌株药敏试验结果见表 6、7； 对 13 种抗生素的耐药率、中介率、敏感率分布见图6、7；耐药分布趋势见图8。 3.两组菌株对 13 种抗生素的耐药率经统计学处理除苯唑西林（P＜0.01）外均无显著差异（P＞0.05）。 

第三篇Sul1及aph(3')-III基因的检测┅┅30 

一、材料与方法┅┅┅30 

二、结果┅┅┅┅ 30 

三、讨论┅┅┅┅┅  33 

结  论 ┅┅┅┅  35 

第三篇  Sul1 及 aph(3')-III 基因的检测                                                              

一、材料与方法 

1.来源 

上述实验检出的耐复方新诺明葡萄球菌 104 株，耐庆大霉素葡萄球菌44株。 

2.引物 

由上海生物工程公司合成2对引物，参见Sara等人报道设计的扩增Sul1基因的引物，序列为P1：5'－CTTCGATGAGAGCCGCGCGC-3'、P2：5'－GCAAGGCGGAAACCCGCGCC-3',扩增的片段为436bp[44]；参见糜祖煌等人报道设计的扩增aph(3')-III基因的引物，序列为P1：5'－GCCGATGTGGATTGCGAAAA-3'、P2：5'－GCTTGATCCCCAGTAAGTCA -3'，扩增的片断292bp[。 

3.主要实验试剂及仪器 

普通营养琼脂                 杭州天和生物制品公司 

TaqDNA聚合酶                 北京鼎国生物技术发展中心 

dNTPs                        北京鼎国生物技术发展中心 

琼脂糖                        Spain 

2000bpDNA Marker              北京鼎国生物技术发展中心 

500 bpDNA Marker               北京鼎国生物技术发展中心 

三用恒温水浴箱 SHH-W21Y420  北京长安科学仪器厂 

TGL-16B  低温离心机           中国上海安亭科学仪器厂  

Gne AmpRPCR System 2700        Applied Biosystem USA    

DY-WZ电泳仪                    北京生化仪器厂 

DYY-III型水平电泳槽            北京市六一仪器厂

UV WHITE –2020D 凝胶成像分析系统        美国 

4.相关试剂的配制    

50×TAE:          242g          Tris碱， 

57.1ml        冰乙酸， 

100ml         0.5mol/LEDTA(PH=8.0)                     

1000ml        蒸馏水   

溴酚兰指示剂：10ml 溶液中含有:                   

100%甘油               5ml                       

0.5mol/L EDTA(pH=8.0)   2.5ml                       

10% SDS                1ml                       

溴酚兰                  5mg                       

二甲苯胺                5mg                       

蒸馏水                  1.5ml 

结    论  

1.四平地区呼吸科住院儿童100%应用抗生素,且抗生素品种单一，主要追求高价位、高档次的头孢二代及三代抗生素，选用及换用抗生素不以细菌检测及药敏试验结果为依据，靠经验用药，少数病例无明确指征频繁更换抗生素，一些常用抗生素应用过量。 

2.两组葡萄球菌对青霉素和苯唑西林表现高度耐药，而对AMP/SBT敏感性较高，因此青霉素和苯唑西林单独应用对葡萄球菌引起的感染失去治疗意义，必要时可根据联合药敏试验结果与其他抗生素联用，AMP/SBT抗葡萄球菌作用肯定，可广泛用于儿科葡萄球菌感染性疾病。 

3.两组葡萄球菌对第一代头孢菌素的敏感率均高于第二代及第三代头孢菌素，因此临床治疗葡萄球菌感染，第一代头孢菌素优于第二代及第三代头孢菌素。 

4.未应用抗生素组及应用抗生素组葡萄球菌对对红霉素耐药率较高，临床可将红霉素与其他敏感且与之有协同作用的抗生素联用。 

5.两组菌株庆大霉素的敏感率高，临床可适当选用，但要严格按儿科规定剂量用药。 

6.两组葡萄球菌对万古霉素的敏感率高，抗葡萄球菌疗效显著，但万古霉素具有耳、肾毒性、静脉滴注相关性不良反应及血液系统毒性不良反应，因此通常不作为儿科一线药物应用, 只有在常用抗菌药物无效或不能应用( 如青霉素过敏) 时使用。 

7.两组葡萄球菌对13种抗生素的耐药分布趋势相似，耐药性无显著差异，说明该地区可能存在细菌耐药性迅速播散。 

8.四平地区葡萄球菌磺胺类药物耐药不是由Sul1基因编码控制的。

9.aph(3')-III基因是四平地区葡萄球菌耐氨基糖苷类抗生素的主要遗传因素。
 

参考文献:

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