CD36对骨骼肌脂肪酸代谢调控的机制研究

发布时间：2017-10-10 19:20

  本文关键词：CD36对骨骼肌脂肪酸代谢调控的机制研究

  更多相关文章： 脂肪酸转移酶 骨骼肌 棕榈酸 腺苷酸活化蛋白激酶 肝激酶B1 C2C12骨骼肌细胞 自主运动

【摘要】：骨骼肌是胰岛素刺激下糖脂代谢的主要外周组织,在维持机体能量平衡中起到了重要的作用。骨骼肌胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要特征,表现为因过量脂肪酸及其衍生物的堆积导致的骨骼肌对胰岛素敏感性的下降。在正常骨骼肌细胞中,脂肪酸的摄取、转运及氧化三者处于平衡状态,使骨骼肌细胞内脂肪酸及其衍生物的浓度保持在较低的水平,避免因高浓度脂类积聚对细胞功能造成的损伤。CD36是一种能够转运长链脂肪酸进入骨骼肌细胞的整合膜蛋白。目前对CD36的研究多集中在脂肪酸的转运及摄取方面,对CD36在脂肪酸氧化代谢中的作用及作用机制研究还较少。AMPK作为调控骨骼肌脂肪酸氧化代谢的关键因素,CD36是否能够通过激活AMPK对脂肪酸氧化代谢进行调控,尚不清楚。 目的：本研究描述了CD36-AMPK通路在骨骼肌脂肪酸摄取及氧化过程中的调控作用。首先利用细胞模型,探讨了基础状态下CD36缺乏激活AMPK的作用机制,期望可以为研究CD36对骨骼肌脂肪酸氧化代谢的调控,提供一个新的思路；另鉴于棕榈酸代谢对骨骼肌及整个机体能量代谢的重要意义,本研究进一步探讨了棕榈酸作用下CD36激活AMPK的作用机制,期望可以为认识胰岛素抵抗等代谢性疾病的发生、发展提供一些科学参考；最后,通过建立骨骼肌脂肪酸氧化代谢水平不同的高脂膳食、自主运动及能量限制干预的动物模型,观察了不同干预方式对CD36总蛋白含量的影响,期望可以为CD36总蛋白含量在小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代谢的适应性调控过程中的研究,提供依据。 方法： 1.基础状态下CD36缺乏对小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代谢调控的机制研究 (1)CD36缺乏对AMPK活化水平的影响 1)细胞水平研究CD36对AMPK活化水平的影响：利用siCont或siCD36作用于分化成熟的C2C12小鼠骨骼肌细胞,用western blot法检测CD36缺乏对小鼠骨骼肌细胞AMPK磷酸化水平的影响； 2)动物水平研究CD36对AMPK活化水平的影响：以野生型和CD36基因敲除小鼠腓肠肌和心肌组织为研究对象,用western blot法检测CD36缺乏对小鼠骨骼肌和心肌组织AMPK磷酸化水平的影响。 (2)CD36缺乏激活AMPK的作用机制研究 1)CD36缺乏对LKB1磷酸化水平的影响：以CHO-Vector和CHO-CD36细胞为研究对象,用immunoprecipitation法检测CD36缺乏对LKB1磷酸化水平的影响。 2)CD36缺乏对LKB1向细胞核转运的影响：用immunofluorescent microscopy法观测CD36的缺乏对LKB1向细胞核转运的影响。 (3)CD36缺乏对小鼠骨骼肌细胞棕榈酸氧化水平的影响 1)将siCont或siCD36作用于分化成熟的C2C12小鼠骨骼肌细胞,用Oxygraph-2k线粒体呼吸仪检测CD36缺乏对骨骼肌细胞棕榈酸氧化水平的影响； 2)将siCont或siCD36作用于分化成熟的C2C12小鼠骨骼肌细胞,用western blot法检测CD36缺乏对棕榈酸诱导AMPK/ACC活化水平的影响。 2.棕榈酸作用下CD36对小鼠骨骼肌脂肪酸代谢调控的机制研究 (1)棕榈酸对AMPK活化水平的影响：利用棕榈酸作用于分化成熟的C2C12小鼠骨骼肌细胞,用western blot法检测棕榈酸对小鼠骨骼肌细胞AMPK磷酸化水平的影响。 (2)CD36在棕榈酸诱导AMPK激活中的作用机制研究：以CHO-CD36细胞为研究对象,经过3001μM棕榈酸作用15分钟后,用immunofluorescent microscopy法检测棕榈酸对LKB1向细胞核转运的影响；用co-immunoprecipitation法检测CD36与Fyn、LKB1及AMPK的结合能力。 (3)棕榈酸对CD36向细胞膜转运的影响：以完全分化的C2C12小鼠骨骼肌细胞为研究对象,经过300gM棕榈酸作用0、5、15、30分钟后,用In-Cell Western法检测棕榈酸对CD36向细胞膜转运的影响；用western blot法检测棕榈酸对小鼠骨骼肌细胞AMPK磷酸化水平的影响；用immunoprecipitation法检测棕榈酸对被AMPK磷酸化的TBC1D1水平的影响。 3.高脂膳食、运动及能量限制干预下小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代谢水平不同对CD36总蛋白含量的影响 清洁级雄性C57小鼠40只,随机分为四组：对照组(N,n=10)、高脂膳食组(HD,n=10)、自主跑轮运动组(E,n=10)及能量限制组(CR,n=10)。经过8周干预后,实验结束。小鼠断颈处死,摘取右侧股四头肌。 (1)不同干预方式对小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代谢水平的影响：用western blot法分别检测了高脂膳食、自主运动及能量限制对小鼠骨骼肌脂肪酸氧化信号通路AMPK/ACC活化水平的影响。从而建立了小鼠骨骼肌脂肪酸氧化水平不同的动物模型。 (2)小鼠骨骼肌脂肪酸氧化水平不同对CD36总蛋白含量的影响：用western blot法首先检测了不同干预方式对CD36总蛋白含量的影响,然后进一步检测了CD36总蛋白含量在不同骨骼肌脂肪酸氧化代谢水平中的差异。 结果： (1)与siCont相比,经2种siCD36干扰后的C2C12细胞中pAMPK(T172)/AMPK显著增加(P0.05,P0.01)；与WT小鼠相比,CD36-/小鼠骨骼肌(P0.01)及心肌组织中pAMPK(T172)/AMPK显著增加(P0.05)。 (2)与CHO-CD36细胞相比,CHO-Vector细胞中LKB1的磷酸化水平有明显的减少,并且LKB1大量存在于细胞质中(P0.05)。与此同时,CHO-Vector细胞中AMPK磷酸化水平整体较高(P0.01)。 (3)棕榈酸作用于经siCont转染的C2C12细胞15分钟后,AMPK活化水平明显增加(P0.001),然而棕榈酸并没有导致经siCD36转染的C2C12细胞AMPK活化水平的进一步增加(P0.05)。 (4)在CHO-CD36细胞中,棕榈酸能够明显抑制LKB1向细胞核的转运。 (5)在CHO-CD36细胞中,棕榈酸能够减少CD36与Fyn的结合能力,同时增加CD36与LKB1及AMPK的结合能力。 (6)在完全分化的C2C12细胞中,细胞膜CD36的含量随着棕榈酸作用时间的延长而增加,其中在棕榈酸作用30分钟时,细胞膜CD36的含量有显著的增加(P0.05)；并且AMPK、TBC1D1磷酸化水平的增加也呈棕榈酸作用的时间依赖性。 (7)与对照组小鼠相比,经过8周高脂膳食干预的小鼠骨骼肌CD36总蛋白表达水平显著减少(P0.01),经过8周自主运动干预的小鼠骨骼肌CD36总蛋白表达水平无明显变化(P0.05),经过8周能量限制干预的小鼠骨骼肌CD36总蛋白表达水平显著增加(P0.01)；与高脂膳食组小鼠相比,经过8周自主跑轮运动及能量限制的小鼠骨骼肌CD36总蛋白表达水平有显著增加(P0.01)。 结论： (1)离体、在体实验均表明,CD36缺乏能够激活骨骼肌AMPK。其作用机制可能为：CD36缺乏导致了CD36对Fyn的磷酸化水平减少,进一步减少了Fyn对LKB1的磷酸化作用,LKB1磷酸化水平的减少抑制了LKB1向细胞核的转运,从而激活AMPK。 (2)基础状态下CD36的缺乏导致了骨骼肌AMPK/ACC磷酸化水平及脂肪酸氧化水平的增加,然而CD36的缺乏又损伤了棕榈酸对AMPK激活的敏感性。说明CD36的存在对骨骼肌脂肪酸氧化代谢的调控起到了重要作用。 (3)当外源性棕榈酸附着于细胞膜CD36表面时,Fyn与CD36相分离,减少了Fyn对LKB1的磷酸化作用,抑制LKB1向细胞核的转运,从而增加了LKB1对AMPK的激活作用。与此同时,棕榈酸与CD36的结合,还可能通过增加CD36与LKB1及CD36与AMPK的结合能力,在棕榈酸的作用下形成CD36-LKB1-AMPK复合物,LKB1与AMPK空间距离的靠近,进一步增加了LKB1对AMPK的激活作用。 (4)棕榈酸可能通过激活骨骼肌AMPK/TBC1D1信号通路,诱导CD36向细胞膜的转运,但无法诱导CD36向线粒体膜的转运。 (5)骨骼肌脂肪酸氧化水平较高的自主运动及能量限制小鼠CD36的总蛋白含量也显著高于高脂膳食小鼠。该结果说明了CD36总蛋白含量的变化可能是对不同小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代谢水平的一种适应性调控。
【关键词】：脂肪酸转移酶 骨骼肌 棕榈酸 腺苷酸活化蛋白激酶 肝激酶B1 C2C12骨骼肌细胞 自主运动
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：G804.7
【目录】：

• 论文摘要6-10
• ABSTRACT10-17
• 第一部分 研究基础(文献综述)17-41
• 前言17-18
• 第一章 CD36与脂肪酸代谢18-26
• 第一节 CD36与脂肪酸摄取18-24
• 第二节 CD36与脂肪酸氧化24-26
• 第二章 CD36与运动26-33
• 第一节 运动过程中各组织CD36的工作模式26-27
• 第二节 运动对CD36转运的影响27-28
• 第三节 骨骼肌CD36的运动适应28-33
• 第三章 CD36与代谢性疾病33-41
• 第一节 CD36与高脂膳食诱导的肥胖及肥胖抵抗33-36
• 第二节 CD36与胰岛素抵抗36-38
• 第三节 其它组织中的CD36与代谢性疾病38-41
• 第二部分 研究报告41-126
• 前言41-42
• 第一章 基础状态下CD36缺乏对骨骼肌脂肪酸氧化代谢调控的机制研究42-77
• 前言42-43
• 第一节 CD36缺乏对小鼠骨骼肌AMPK激活的影响43-54
• 第二节 CD36缺乏激活AMPK的作用机制研究54-67
• 第三节 CD36缺乏对小鼠骨骼肌细胞脂肪酸氧化代谢的影响67-74
• 本章小结74-77
• 第二章 棕榈酸作用下CD36对脂肪酸代谢调控的机制研究77-105
• 前言77-78
• 第一节 棕榈酸对小鼠骨骼肌细胞AMPK激活的影响78-83
• 第二节 CD36在棕榈酸激活AMPK中的机制研究83-92
• 第三节 棕榈酸对CD36向细胞膜转运的影响92-103
• 本章小结103-105
• 第三章 高脂膳食、运动及能量限制下骨骼肌脂肪酸氧化代谢水平不同对CD36总蛋白含量的影响105-124
• 前言105-106
• 第一节 高脂膳食、自主运动及能量限制三种不同干预方式对小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代谢水平的影响106-117
• 第二节 高脂膳食、运动及能量限制三种不同干预方式对CD36总蛋白含量的影响117-124
• 本章小结124-126
• 第三部分 研究总结126-131
• 一. 主要结果与结论126-127
• 二、研究意义与创新127-129
• 三、主要缺陷与不足129-131
• 附录131-161
• 参考文献161-187
• 后记187-188
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果188

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