MicroRNA-520a-3p对非小细胞肺癌增殖、淋巴转移影响的机制研究

发布时间：2017-10-14 12:38

  本文关键词：MicroRNA-520a-3p对非小细胞肺癌增殖、淋巴转移影响的机制研究

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【摘要】：背景与目的肺癌的发病率和死亡率现均居恶性肿瘤首位,统计学研究发现,近50年来,16%~69%的国家和地区肺癌发病率较以往有显著增加。非小细胞肺癌是肺癌的主要类型之一,近年来发病率上升尤为明显。影响非小细胞肺癌生存的主要原因是肿瘤的复发和转移,其中淋巴转移占据重要地位,且许多非小细胞肺癌淋巴转移早于血行转移或是唯一的转移途径。研究非小细胞肺癌淋巴转移的分子机制和信号转导通路具有重要的理论与临床意义。虽然国内外学者对非小细胞肺癌淋巴转移及其细胞信号转导进行了一些探索,发现肿瘤淋巴管生成是其中的重要环节,但目前对非小细胞肺癌淋巴转移及淋巴管生成的分子机制尚未完全阐明。MicroRNA(mi RNAs)是一类长约18-25个核苷酸的内源性非编码RNA,可通过与靶基因的mRNA 3'非翻译区(3'UTR)结合来诱导该mRNA的降解或抑制mRNA翻译过程。近期研究证实,mi RNA也可以作为原癌基因和抑癌基因,在基因调控、细胞凋亡、细胞分化和肿瘤相关的基因损伤修复过程中发挥重要作用。现已发现多种miRNA具有抑制肿瘤的功效。miR-520a来自人miR-520家族,该家族定位于人第19号染色体。目前研究发现,mi R-520a在结肠癌、乳腺癌、髓系白血病和食管鳞癌等多种肿瘤中发挥重要的抑癌作用,但mi R-520a-3p对非小细胞肺癌的发生和转移有何影响,尚不明确。本研究旨在研究miR-520a-3p在非小细胞肺癌的发生和淋巴转移中的作用:通过对非小细胞肺癌临床标本的检测和分析考察miR-520a-3p对非小细胞肺癌发生、发展、恶变和淋巴结转移之间的关系;通过体外和体内实验进一步探讨miR-520a-3p在调控非小细胞肺癌发生、发展和淋巴结转移的过程中的具体作用及分子机制,通过干预miR-520a-3p的表达水平,采用生物信息学工具和萤光素酶报告基因测定法寻找miR-520a-3p可能的靶分子,并在体内和体外进行验证和初步的功能分析,以期明确miR-520a-3p在非小细胞肺癌发病过程中所起的具体作用,为非小细胞肺癌的诊断和治疗提供新的方向。方法1.通过收集临床非小细胞肺癌患者的肿瘤、瘤周及淋巴结标本,根据不同组织中mir-520-3p的表达水平,以及肿瘤分期、转移淋巴结数量、淋巴结转移部位等,初步分析mir-520a-3p与非小细胞肺癌的发展、侵袭和转移的关系。进一步通过检测肿瘤、瘤周组织中新生淋巴管标志物lyve-1的表达水平与mir-520a-3p表达水平的相关性来分析mir-520a-3p调控非小细胞肺癌淋巴转移可能机制。2.以非小细胞肺癌a549细胞株为研究对象,使用mir-520a-3p特异性抑制剂反义寡核苷酸和人工合成的mir-520a-3p类似物构建高表达和低表达mir-520a-3p的a549细胞株,并采用mtt细胞增殖实验、流式细胞技术检测、transwell细胞爬孔实验和划痕实验等手段,考察mir-520a-3p对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡等生物学行为的影响。3.通过构建裸鼠移植瘤模型,对不同mir-520a-3p表达水平的a549细胞移植瘤发生、发展过程和成瘤大小、重量及转移情况进行比较,qrt-pcr和westernblot检测各组移植瘤样本中淋巴管内皮标志物lyve-1的表达水平,进一步考察mir-520a-3p对非小细胞肺癌的侵袭和淋巴转移能力的影响。4.使用荧光素酶报告基因法检测mir-520a-3p可能的靶分子,并通过qrt-pcr、westernblot、免疫荧光等实验,进一步验证mir-520a-3p可能的下游靶分子间的关系,并寻找在mir-520a-3p调控下游靶分子的过程中可能发挥作用的信号通路分子,探讨mir-520a-3p抑制非小细胞肺癌淋巴结转移的机制。结果1.我们采用qrt-pcr方法检测了nsclc患者肿瘤、瘤周组织中mir-520a-3p的表达水平,发现肿瘤组织中mir-520a-3p表达水平明显低于瘤周组织,而mir-520a-3p与肿瘤淋巴转移的发生呈高度相关,即mir-520a-3p表达水平低的患者,发生淋巴转移的概率较高,预后较差。mir-520a-3p表达水平与lyve-1负相关。2.采用mtt、流式细胞计数、划痕实验、transwell实验等检测mir-520a-3p对非小细胞肺癌a549细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响。实验证实:mir-520a-3p可显著抑制非小细胞肺癌的增殖、侵袭和迁移能力,而对细胞凋亡有促进作用。3.通过在裸鼠右侧臀部皮下注射mir-520a-3p高、中、低表达的非小细胞肺癌a549细胞株,制作裸鼠异位皮下移植瘤模型。构建过程中发现,高表达mir-520a-3p的a549细胞株成瘤过程较缓慢,最终成瘤的体积、重量均较小,而低表达mir-520a-3p的a549细胞株成瘤速度快,最终成瘤的体积、重量均较大。因此mir-520a-3p可能作为一种抑癌因子,抑制非小细胞肺癌的生长。进一步研究发现,miR-520a-3p表达水平较低的裸鼠移植瘤组织和瘤周组织中淋巴管内皮细胞特异性标志物LYVE-1表达较高,而miR-520a-3p表达水平较高的移植瘤组织和瘤周组织中LYVE-1表达则较低。4.从体内与体外实验角度考察和分析了miR-520a-3p调控非小细胞肺癌增殖与转移的可能机制。首先,通过对mi R-520a-3p序列的生物信息学分析选取其可能的靶分子为MAP3K2,使用miR-520a-3p抑制剂处理野生型HEK-293细胞和MAP3K2 3'非编码区突变的HEK-293,并检测二者MAP3K2的表达水平,结果提示,野生型HEK-293细胞中的MAP3K2蛋白表达水平显著降低,而MAP3K2 3'非编码区突变的HEK-293细胞中MAP3K2蛋白表达水平无明显变化。进一步通过检测不同mi R-520a-3p表达水平的A549细胞中MAP3K2蛋白的表达水平发现,MAP3K2的表达水平与mi R-520a-3p表达水平负相关,即miR-520a-3p高表达的A549细胞中MAP3K2蛋白表达水平较低,而经miR-520a-3p抑制剂处理后低表达miR-520a-3p的A549细胞中MAP3K2蛋白表达水平较高。在体内实验中,western blot检测发现MAP3K2、caspase 3、bcl-2的表达水平均随miR-520a-3p表达水平变化。其中MAP3K2、caspase 3与miR-520a-3p呈负相关,而bcl-2与mi R-520a-3p为正相关。结论1.miR-520a-3p在NSCLC患者的肿瘤组织中表达水平低于瘤周组织;肿瘤的恶性程度越高,miR-520a-3p表达水平越低;发生淋巴转移病例的肿瘤组织标本中miR-520a-3p表达水平更低;miR-520a-3p与LYVE-1表达水平呈负相关。2.非小细胞肺癌A549细胞中miR-520a-3p表达水平较低;mi R-520a-3p表达水平与A549细胞的增殖、侵袭和迁移能力呈负相关,与A549细胞的凋亡水平呈正相关。3.成功构建裸鼠右侧臀部皮下异位移植瘤模型;mi R-520a-3p表达水平与肿瘤的发生、发展呈负相关,miR-520a-3p与LYVE-1表达水平呈负相关,与肿瘤的淋巴管生成呈负相关。4.miR-520a-3p表达水平与MAP3K2、caspase 3负相关,与bcl-2呈正相关,即miR-520a-3p可能通过影响MAP3K2、caspase 3、bcl-2的表达而调控非小细胞肺癌的生长、增殖、侵袭和转移。
【关键词】：miR-520a-3p 非小细胞肺癌 肿瘤生长 迁移和侵袭
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 缩略语表5-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-17
• 第二章 miR-520a-3p对非小细胞肺癌生物学行为的影响17-32
• 2.1 材料与方法18-23
• 2.2 结果23-28
• 2.3 讨论28-31
• 2.4 小结31-32
• 第三章 miR-520a-3p对非小细胞肺癌细胞的生物学影响32-47
• 3.1 材料和方法32-37
• 3.2 结果37-42
• 3.3 讨论42-46
• 3.4 小结46-47
• 第四章 miR-520a-3p调控非小细胞肺癌生长、淋巴转移在体实验47-66
• 4.1 材料和方法47-56
• 4.2 结果56-61
• 4.3 讨论61-64
• 4.4 小结64-66
• 第五章 miR-520a-3p抑制非小细胞肺癌淋巴结转移的机制研究66-87
• 5.1 材料和方法66-78
• 5.2 结果78-83
• 5.3 讨论83-86
• 5.4 小结86-87
• 全文结论87-89
• 参考文献89-100
• 文献综述 miRNA在非小细胞肺癌中的作用100-108
• 参考文献105-108
• 攻读博士期间发表论文情况108-109
• 致谢109

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本文编号：1031137