DHHC蛋白家族成员（ZDHHC16、ZDHHC17）在神经系统发育过程中的作用及其机制研究

发布时间：2017-10-14 20:15

  本文关键词：DHHC蛋白家族成员（ZDHHC16、ZDHHC17）在神经系统发育过程中的作用及其机制研究

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【摘要】：研究报道证实,细胞内的前体蛋白在翻译装配完成后,需要进行一系列的修饰才能成为具备生物学活性的成熟蛋白,执行生命活动功能。蛋白质翻译后修饰的主要方式包括：泛素化修饰、磷酸化修饰、糖基化修饰和脂质化修饰等。其中,脂质化修饰对于蛋白质在细胞内的运输,分选以及功能的完成至关重要。通过脂质化修饰后的成熟蛋白疏水性增高,与质膜系统的脂质双分子层的融合性增强,促进蛋白质的亚细胞定位和生命活动的执行。目前已知的脂质化修饰方式约有五种,蛋白的棕榈酰化修饰是最近几十年刚刚发现的一种重要的脂质化修饰方式。棕榈酰化修饰的过程是指将16碳的饱和脂肪酸-棕榈酸,通过特定的化学键连接到被修饰蛋白特定的半胱氨酸位点上。目前从酵母到哺乳动物中筛选得到的可被棕榈酰化修饰的蛋白已达上百种。目前,最为常见的棕榈酰化修饰类型是S-型,其主要通过硫脂键连接棕榈酸和被修饰蛋白的半胱氨酸位点。与其他四种脂质化修饰方式不同,棕榈酰化修饰的过程具有动态可逆性,可通过棕榈酰化／去棕榈酰化过程,动态的调节被修饰蛋白的活性,从而调控被修饰蛋白的胞内转运、靶向融合、下游信号转导等,继而影响细胞的生命活动。虽然蛋白棕榈酰化修饰在四十多年前已被发现,然而最近十几年棕榈酰化修饰酶的发现,才使得对于该种修饰方式和被修饰蛋白的研究取得了突破性的进展。最初,一个重要的发现来自于对酵母的遗传分析,人们在酿酒酵母中首次发现了包括Erf2和Akr1在内的八种基因编码的与棕榈酰化修饰有关的蛋白,并且提出了棕榈酰转移酶(Palmitoyltransferases, PATs)家族的存在,这一类蛋白的结构具有共同的特征,都含有特征性的锌指样(Zinc finger)-DHHC (Aspartate-histidine-histidine-cysteine)-CRD (Cysteine rich domain)结构域,因此这类蛋白又被称为DHHC蛋白家族,该家族的大多数成员具有棕榈酰转移酶活性。2004年,Bredt研究小组完成了人类与小鼠基因组23种DHHC蛋白基因的克隆和鉴定,与此同时,最近发展的蛋白质组学研究和影像学技术的进步,加速了人们对这类蛋白功能的认识。近年来研究工作表明,棕榈酰化修饰主要发生在神经蛋白,随着对DHHC蛋白-底物研究的日益深入,该家族成员的功能越来越多的被揭示出来。目前认为,DHHC蛋白与神经系统的发育、生理活动以及某些神经、精神类疾病的发生密切相关。首先,在神经元的各种特化结构如轴突,树突等形成和生长的过程中,多种关键蛋白可被棕榈酰化修饰。如神经细胞粘附分子140 (neural cell adhesion molecule 140,NCAM140)和NCAM180的棕榈酰化修饰有利于其在生长锥细胞膜的脂筏上定位,这一过程对于调控神经元轴突的生长是必不可少的,研究表明,ZDHHC7和ZDHHC3均表现出对NCAM的棕榈酰化修饰活性。其次,在神经干细胞的发育过程中,DHHC家族成员也发挥着重要的作用。参与神经干细胞的生成,自我更新及命运决定过程的多条信号通路中的关键分子均可被棕榈酰化修饰,如WNT3a, SHH (Sonic hedgehog, SHH)等。最新的研究证实,flotillin-2可被ZDHHC5棕榈酰化修饰,继而影响神经干细胞向神经元方向的分化。另外,DHHC蛋白还参与调节神经末梢突触递质的释放,从而调控突触的功能。在神经突触的前后膜上富含可被棕榈酰化修饰的蛋白,如突触相关蛋白25 (Synaptosome associated protein-25, SNAP-25),突触后致密蛋白95(Postsynaptic density protein 95)等,其棕榈酰化水平的改变将影响这些突触蛋白在前后膜的定位。目前已证实ZDHHC2, ZDHHC3, ZDHHC15, ZDHHC17均可介导上述蛋白的棕榈酰化修饰,与上述蛋白在胞质内的分选,运输和突触前后膜上的靶向聚集密切相关。同时,近年来的研究工作也证实,DHHC蛋白成员可以介导突触前后膜上多种离子通道亚基的棕榈酰化修饰,动态的调控离子通道的活性,调节神经信号的传导。最为重要的是,对于哺乳动物的基因遗传学研究发现,该家族成员与多种神经退行性病变和与学习记忆密切相关的神经精神类疾病有关,如ZDHHC8的缺失可能诱发精神分裂症；对伴X连锁智力发育迟滞的一个家系进行遗传多态性分析证实ZDHHC15的突变缺失导致该疾病的发生；ZDHHC17与Huntington舞蹈症的发病有关；ZDHHC12参与调节APP的代谢,暗示ZDHHC12可能与Alzheimer'sdisease的发生密切相关。这些研究结果表明DHHC蛋白家族成员在神经系统正常结构的建立以及功能的完成过程中发挥着举足轻重的作用,故而深入的研究这一类蛋白的功能不仅具有深刻的科学价值还具有很大的临床指导意义。然而目前对这个家族蛋白功能的研究大多停留在体外水平,体内研究尚且处在起步阶段。虽然目前已经建立了ZDHHC5,8,17基因敲除小鼠模型,但其在体内的作用机制尚不明确。同时,小鼠的发育模式也不利于观察棕榈酰化作用在胚胎发育尤其是神经系统发育中的作用。而模式动物斑马鱼,发育迅速,遗传背景清晰,并具有完全透明的身体,便于观察和实验操作,因此被广泛的应用于神经系统发育的研究。本研究选取模式动物斑马鱼为实验对象,利用反向遗传学手段,研究DHHC家族成员在胚胎神经发育中的作用及分子机制。第一部分ZDHHC16在神经干细胞增殖中的作用及机制研究背景介绍ZDHHC16 (zinc finger DHHC-type containing 16)是哺乳动物23种DHHC蛋白中的第16号成员。该基因编码的氨基酸序列高度保守。分析斑马鱼的zdhhcl6基因发现,基因全1749bp,编码一个由387个氨基酸组成的蛋白质。与其他成员相比,目前关于该基因的研究报道还比较少,且均停留于体外水平。研究表明,ZDHHC16可以激活c-Abl,参与调控细胞的凋亡程序。但是,ZDHHC16在神经系统发育过程中的功能目前尚无文献报道。因此,实验通过胚胎整封原位杂交(Whole-mount in situ hybridization, WISH)、免疫组化、聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)等方法研究抑制ZDHHC16表达后的胚胎表型,探讨ZDHHC16在神经系统发育中的功能,明确ZDHHC16对神经干细胞生命活动的调控作用,并深入研究ZDHHC16的棕榈酰化修饰活性对神经干细胞发育信号分子的作用。研究内容首先,为了了解ZDHHC16在斑马鱼胚胎的时空表达模式,本研究设计合成了zdhhc16特异性引物和地高辛标记的RNA探针,利用RT-PCR技术和WISH技术,检测zdhhc16在斑马鱼胚胎发育各时期的表达以及分布情况。结果表明,zdhhc16为母源性表达,且在神经板形成阶段,表达水平显著增高。同时,zdhhc16集中表达于斑马鱼胚胎神经板的最前端,这一结果暗示该基因可能参与调节神经系统特别是前脑的发育过程。为了研究ZDHHC16对斑马鱼神经系统发育的影响,本研究利用反向遗传学手段,设计合成针对zdhhc16的Morpholino (MO),在斑马鱼胚胎发育至1-2细胞期时利用显微注射技术注入胚胎,观察表型。结果显示,与对照组相比,抑制ZDHHC16表达后,在胚胎发育至10hpf (Hours post fertilization)时,神经板前端表现出缺陷,至24hpf时胚胎呈现出端脑体积缩小甚至缺失的表型。48hpf胚胎石蜡切片HE染色结果也证实了这一结果。为了进一步揭示ZDHHC16对胚胎神经系统发育,尤其是明确其在端脑发育中的作用,本研究利用原位杂交技术,检测多个标志基因的表达变化。结果显示,抑制ZDHHC16表达后,24hpf胚胎中后脑的标记基因otx2 (Orthodenticle homeobox 2), pax2a (Paired box 2a), krox20 (Early growth response 2)表达均正常,而端脑标记基因foxg1 (Forkhead box G1), emx2 (Empty spiracles homeobox 2), dlx2 (Distal-less homeobox 2)的表达均出现不同程度的减弱,免疫组化检测神经元标记基因acetylated a-tubulin的表达也进一步证实了这一结果。上述结果暗示ZDHHC16在神经系统发育过程中参与端脑发育的调控。由于抑制ZDHHC16后胚胎在神经发育早期出现缺陷,因此我们利用原位杂交技术,在神经板形成阶段(75%下包期)检测神经标记基因sox3 (Sex determining region Y-box 3)和rx3 (Retinal homeobox gene 3)的表达。结果显示,与对照组相比,其在神经板前端的表达减弱,提示ZDHHC16可能参与了胚胎端脑神经干细胞生命活动的调控。接下来,分别在体内水平和体外水平,研究ZDHHC16对端脑神经干细胞的作用。利用原位杂交和RT-PCR技术检测神经干细胞标记基因sox2的表达水平,发现抑制ZDHHC16后sox2 (Sex determining region Y-box 2)的表达减弱,mRNA水平降低,提示神经干细胞的数量减少。接着,利用BrdU掺入实验,RT-PCR和原位杂交检测增殖相关基因-pcna (Proliferating cell nuclear antigen)和mcm5 (Minichromosome maintenance complex component 5),切片TUNEL染色技术,分别检测端脑处神经干细胞的增殖水平和凋亡情况。结果显示,抑制ZDHHC16的表达后,凋亡的神经干细胞数量没有明显的变化,而端脑处神经干细胞的增殖水平减弱。同时,在体外培养的原代神经干细胞中得到的实验结果,与体内的结果一致,也进一步验证了上述结论。最后,为了探索ZDHHC16调控端脑神经干细胞增殖的机制。本研究利用RT-PCR技术检测参与神经干细胞增殖的多条信号通路下游关键因子的表达水平,结果显示,抑制ZDHHC16的表达,FGF通路下游的转录因子pea (ets variant 4), erm (ets variant 5)的mRNA表达水平显著下降,接着,通过Western blot检测FGF通路关键效应蛋白ERK的磷酸化水平,结果也出现了显著的下调。此外,利用Western blot技术检测FGF通路中配体和受体蛋白的表达水平,发现抑制ZDHHC16并不会影响上述基因mRNA和蛋白的表达水平,暗示ZDHHC16通过影响ERK上游激酶的活性发挥作用。同时,本研究通过体外合成ZDHHC16ADHHC表达载体,与zdhhc16 MO共同注射斑马鱼胚胎进行挽救实验,发现ZDHHC16ADHHC并不能像野生型ZDHHC16一样挽救注射表型,上调ERK的磷酸化水平,因此我们推测ZDHHC16通过其棕榈酰化修饰作用,影响ERK上游的MEK蛋白激酶的活性,调节ERK的磷酸化水平,进而发挥调控端脑神经干细胞增殖的功能。结论神经干细胞具有自我更新的特性,其数量的维持和命运的决定依赖于一系列复杂的内外源性因子和信号分子为其提供精确稳定的环境。神经干细胞的增殖、分化、凋亡等事件正确有序的进行对于神经系统正常发育以及功能的完成具有至关重要的作用。本研究以斑马鱼为模型,探索ZDHHC16对端脑神经干细胞增殖的作用及机制。本研究发现,在胚胎神经系统的发育过程中,ZDHHC16通过其棕榈酰转移酶活性,调节FGF/ERK信号通路的转导,继而促进端脑神经干细胞的增殖。本研究加深了DHHC蛋白家族及蛋白的棕榈酰化修饰作用在神经发育中的功能的理解,同时也为神经管发育畸形的研究特别是对端脑缺陷的研究和临床治疗提供了新线索。第二部分ZDHHC17在神经元轴突生长过程中的作用及机制研究背景介绍ZDHHC17 (zinc finger DHHC-type containing 17)是哺乳动物中23种DHHC蛋白中的第17号成员,该基因编码含633个氨基酸的蛋白,其蛋白结构包括N-端的6-8个锚蛋白重复序列(Ankyrinrepeats, ANK)以及五个跨膜螺旋,其特征性的DHHC结构域位于靠近第四个跨膜螺旋的位置。研究证实,ZDHHC17在体内主要表达于神经系统,暗示该蛋白的功能可能特异性的与神经系统的发育和生命活动有关。近年来对于ZDHHC17功能的研究主要集中在与某些神经系统疾病发生的关系。目前建立的ZDHHC17基因敲除小鼠模型表现出与人类的亨廷顿舞蹈症类似的表型,提示该基因可能与亨廷顿舞蹈症的发生密切相关。同时,许多参与调控神经信号传递的关键蛋白,如SNAP25、PSD95等均可被ZDHHC17棕榈酰化修饰。另外,研究表明,ZDHHC17可以修饰Mg2+、Ca2+等离子通道,调控神经递质的释放。最新的研究发现,ZDHHC17可以活化JNK (c-Jun N-terminus kinase, JNK)信号通路,参与调节下游信号通路的传导。然而,关于ZDHHC17在神经发育中的作用及分子机制,目前尚无人涉及。因此本研究选取斑马鱼为动物模型,利用显微注射MO的方法,建立ZDHHC17-knockdown胚胎模型,同时通过建立原代培养神经干细胞定向诱导分化的细胞模型和神经生长因子(Nerve growth factor, NGF)诱导的PC12细胞定向分化为神经元的体外模型,利用RNAi技术,共同探讨ZDHHC17在胚胎神经系统发育过程中的作用及分子机制。研究内容首先,为了研究ZDHHC17在斑马鱼胚胎神经发育中的作用,本部分研究利用RT-PCR技术和WISH技术,检测zdhhc17 mRNA在斑马鱼胚胎中的时空表达谱。结果显示,zdhhc17集中表达于神经系统,且从尾芽期开始,表达水平显著增高。接着,我们选取1-2细胞期胚胎,显微注射zdhhc17 MO抑制ZDHHC17蛋白的翻译,构建ZDHHC17-knockdown胚胎模型,同时注射小鼠zdhhc17 mRNA构建ZDHHC17-overexpression模型,并观察表型。结果显示,抑制ZDHHC17表达的胚胎外观与注射Con MO的胚胎没有差别。但是Touch-response test结果显示,抑制ZDHHC17表达后,发育至3dpf (Days post fertilization)的胚胎,运动能力明显降低,表现为受刺激后游动速率减慢,游动距离缩短。利用免疫荧光染色技术检测神经元标记基因Znp-1,结果显示,胚胎发育至28hpf,抑制组胚胎的运动神经元轴突的生长受限,而过表达组胚胎的运动神经元轴突则呈现生长过度的倾向。然而,对于22hpf胚胎的Islet1 (ISL LIM homeobox 1)的染色结果表明,各组间神经元生成的数量并没有明显的差异,提示该蛋白的功能可能与神经元轴突的生成密切相关,并不影响神经干细胞向神经元方向的分化过程。为了进一步验证在体内模型中观察到的结果,本研究又建立了原代培养神经干细胞定向诱导为神经元模型和NGF诱导的PC12细胞定向分化的体外模型,通过RNAi技术抑制ZDHHC17的表达,观察神经元分支生长情况和神经元生成的数量,得到的结果均与体内结果一致。接下来,为了探索ZDHHC17调控神经元轴突生长的作用机制,本研究以NGF诱导的定向分化为神经元的PC12细胞为模型,利用Western blot技术检测参与调控神经元分化的重要信号通路-丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族中的关键因子,包括p-ERK (phosphorylated extracellular regulated MAP kinase, p-ERK), p-JNK, p-p38,结果表明,在抑制ZDHHC17的表达后,ERK的磷酸化水平显著下降,而p-JNK和p-p38的表达则无明显变化。因此,本研究继续探索ZDHHC17促进ERK磷酸化的机制。分析ZDHHC17的蛋白结构,发现其不含有激酶结构域,因此我们推测ZDHHC17通过影响ERK上游其他激酶的活性调控ERK磷酸化。我们构建带有GFP标签的ZDHHC17表达载体,利用免疫共沉淀技术,检测ZDHHC17与ERK上游的激酶TrkA (Tyrosine kinase A, TrkA)和cAMP依赖型蛋白激酶A (cAMP-dependent protein kinase A, PKA)的结合情况。结果表明,ZDHHC17仅可以与TrkA结合。同时免疫荧光检测结果表明,抑制ZDHHC17表达后,表达TrkA阳性的运输囊泡聚集在细胞核的核周,其在胞质内的运输受到抑制,提示ZDHHC17通过促进TrkA在胞质内的运输,调控下游的信号转导。目前的研究认为TrkA在胞质内通常沿着微管网络系统运输,并且可以反作用于微管蛋白(tubulin)、调节微管蛋白的动态平衡。因此我们分别在体内体外,利用免疫共沉淀技术检测tubulin蛋白与TrkA蛋白的相互作用。结果表明,抑制ZDHHC17表达以后,TrkA和tubulin的结合能力减弱,而过表达ZDHHC17可以促进TrkA和tubulin的相互作用。证明ZDHHC17是通过调节TrkA-tubulin复合物的形成,影响TrkA激酶在胞质内的运输,导致下游p-ERK表达水平的变化,继而调控神经元轴突的生长。最后,为了进一步深入研究ZDHHC17促进TrkA-tubulin复合物形成的机制,我们分析ZDHHC17的蛋白结构,发现其含有可能与蛋白识别粘附作用有关的锚蛋白重复序列,因此,我们构建缺失型ZDHHC17蛋白表达载体(ZDHHC17△ANK)转染NGF诱导的PC12细胞模型,利用Westernblot检测ERK的磷酸化水平,结果显示,过表达ZDHHC17△ANK并不能如过表达野生型ZDHHC17一样,显著的提高ERK1/2的磷酸化水平,提示我们ZDHHC17调节神经元轴突生长并不依赖于其棕榈酰转移酶活性,而其锚蛋白结构域参与调控TrkA-tubulin复合物的形成。结论在神经系统的发育过程中,神经元轴突的生成对于突触的形成,神经递质的释放和神经系统功能的实现至关重要。神经元轴突的正常生长依赖于适宜的生长环境和一系列内源性的神经相关蛋白的共同作用。本研究证实,在神经系统的发育过程中,ZDHHC17通过促进TrkA-tubulin复合物的形成,影响下游信号通路的转导,从而调节神经元轴突的生长。与之前的大多数研究不同,本研究结果表明,ZDHHC17蛋白的锚蛋白结构域参与调节TrkA-tubulin复合物的形成,而这一过程是不依赖于其棕榈酰转移酶活性的。上述结果不仅拓展了ZDHHC17在神经发育过程中的作用,深化了其分子调控机制,更是为该家族蛋白作用机制的研究提供了新的视角。
【关键词】：ZDHHC16 神经干细胞 棕榈酰化 端脑 FGF/ERK ZDHHC17 轴突生长 ERK1/2 TrkA Tubulin
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R321
【目录】：

• 中文摘要7-14
• Abstract14-20
• 符号说明20-23
• 前言23-31
• 第一章 ZDHHC16在神经干细胞增殖过程中的作用及机制的研究31-91
• 背景介绍31
• 第一部分 ZDHHC16在胚胎端脑发育过程中作用的研究31-70
• 材料和方法31-61
• 结果61-63
• 讨论63-65
• 结论65
• 附图65-70
• 第二部分 ZDHHC16对神经干细胞存活影响的研究70-81
• 材料和方法70-75
• 结果75-76
• 讨论76-77
• 结论77-78
• 附图78-81
• 第三部分 ZDHHC16调节端脑神经干细胞增殖的机制研究81-91
• 材料方法81-83
• 结果83-85
• 讨论85-87
• 结论87-88
• 附图88-91
• 第二章 ZDHHC17在神经元轴突生长过程中的作用及机制研究91-123
• 背景介绍91
• 第一部分 ZDHHC17在神经元生长过程中作用的研究91-109
• 材料和方法91-98
• 结果98-101
• 讨论101-104
• 结论104
• 附图104-109
• 第二部分 ZDHHC17调控神经元轴突生长的机制研究109-123
• 材料和方法109-113
• 结果113-115
• 讨论115-117
• 结论117-118
• 附图118-123
• 参考文献123-133
• 致谢133-134
• 攻读学位期间发表的学术论文目录134-135
• 学位论文评阅及答辩情况表135-136
• 英文论文1136-158
• 英文论文2158-183

【共引文献】

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本文编号：1032981