胰岛素抵抗大鼠脑组织损伤机制以及番茄红素的保护作用研究

发布时间：2017-10-16 18:33

  本文关键词：胰岛素抵抗大鼠脑组织损伤机制以及番茄红素的保护作用研究

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【摘要】：研究背景机体组织在外界环境或者遗传等因素的影响下可以表现出胰岛素抵抗,其主要特征为胰岛素敏感性降低,常伴随高胰岛素血症和葡萄糖利用障碍。胰岛素发挥其降糖作用的代谢信号途径为：胰岛素可与胰岛素受体(insulin receptor, IR)和胰岛素生长因子样受体1(insulin-like growth factor, IGF-1R)结合,酪氨酸激酶被激活,使得胰岛素受体底物磷酸化,并将下游底物蛋白磷酸化或去磷酸化,从而激活磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B, PKB/AKT),活化的蛋白激酶B可以降低下游糖原合成酶的活性产生抑制作用,促使葡萄糖转运以及糖原合成,使得血糖水平下降。胰岛素抵抗主要是此信号途径发生障碍所致。过去研究主要认为肝脏、骨骼肌和脂肪组织等是胰岛素发挥作用的靶器官,而中枢神经系统(central nervous system, CNS)被认为没有胰岛素发挥作用。近年来,随着胰岛素在脑组织的研究不断深入,越来越多的研究认为脑组织内有胰岛素信号分子的广泛分布同时在脑内可以检测到胰岛素信号通路分子的表达。阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)与2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)风险增加正相关,有研究提出称AD为“3型糖尿病”。而胰岛素信号通路受损正是T2DM与AD两种疾病的共同发病机制之一,胰岛素抵抗又是T2DM的核心特征,因此探索胰岛素信号通路作用机制是明确胰岛素抵抗与AD关系的关键基础。胰岛素抵抗被认为是AD的重要危险因素之一,已有研究表明胰岛素抵抗可以造成脑内Aβ沉积加重,但AD样改变与胰岛素抵抗相关的具体机制仍不明确。氧化应激在包括T2DM和AD的多种病理过程的发生、发展中都起到了重要作用。氧化应激可以造成糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGEs)的过度产生,AGEs可以与其受体(receptor for AGEs, RAGE)结合,进而激活炎症反应中的核心因子转录核因子-KappaB (nuclear factor-kappa B, NF-κB),NF-κB参与调控许多炎症细胞因子的表达,包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-a, TNF-α)和白细胞介素-1β(Interleukin-lbeta, IL-1β)。神经炎症同样参与了AD等神经退行疾病的病理发展,然而胰岛素抵抗脑组织损伤中氧化应激以及炎症反应两方面的系统机制仍不明确。目前由于AD等神经退行疾病的防治缺少有效、低毒的方法,具有药理活性的天然药物逐渐成为研究的焦点,对于多病因、机制复杂的疾病往往起到“霰弹”效果。类胡萝卜素家族中的番茄红素是一种高效的天然抗氧化剂,其抗氧化能力大约是p-胡萝卜素的47倍,维生素E的100倍。番茄红素可以穿越“血脑屏障”进入CNS发挥其抗氧化、清除自由基等生物学功能。近年来,关于番茄红素在中枢神经退行性疾病中的研究不断增多,有研究显示长期摄入番茄红素有助于改善老年人群的认知功能和记忆能力,番茄红素在中枢神经退行性疾病中的防治作用备受关注。因此探讨胰岛素抵抗模型中枢胰岛素信号转导通路分子表达水平改变,以明确中枢胰岛素抵抗机制,进而从AGEs/RAGE、氧化应激和炎症反应几个方面系统全面的探讨胰岛素抵抗动物模型脑组织损伤及番茄红素保护作用的相关机制,可以为揭示AD等神经退行疾病的复杂发病机制并选择有效的防治靶点提供理论依据,同时探究天然药物多效性的特点,从而为从天然药物宝库中发掘有效预防和治疗记忆减退的药物提供现实应用价值。研究目的观察胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性、中枢胰岛素信号通路蛋白表达水平的变化以及番茄红素的干预作用；观察胰岛素抵抗大鼠脑组织认知功能、AGEs/RAGE、抗氧化系统产物、炎症反应因子、PPARy表达等变化以及番茄红素对其的干预作用；进一步探讨胰岛素抵抗脑组织损伤与AD相关的机制以及有效的治疗靶点；探究番茄红素多效性特点,从天然药物宝库中发掘有效预防和治疗记忆减退的药物。研究方法1.动物分组及胰岛素抵抗动物模型的建立6-8周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠32只,按空腹体重编号后随机分为四组,其中包括CNTL组：正常对照组；F组：果糖喂养组；F+LYCO组：番茄红素干预组；LYCO组：番茄红素对照组。F组和F+LYCO组采用标准啮齿类动物饲料喂养,同时给予10%的果糖水喂养16周,建立胰岛素抵抗模型。F+LYCO组在16周果糖水喂养的后10周给予番茄红素(4mg/kg)灌胃。LYCO组同期仅给予同剂量番茄红素灌胃。2.胰岛素抵抗等相关生理指标的检测喂养结束后检测各组大鼠的体重、空腹血糖(fasting blood gluscose,FBG)与空腹胰岛素(fasting insulin, FINS)水平,据此计算胰岛素抵抗系数(HOMA-IR),即HOMA-IR= FBG×FINS/22.5,并以此明确外周胰岛素抵抗是否成功建立。3.行为学检测：药物给予结束后采用Morris水迷宫实验来评估各组实验大鼠的学习和记忆能力。前五天进行航行训练实验,第六天进行空间探索实验。将平台随机隐藏平台预设于四象限之一并保持此位置,在航行训练试验中,头两天记录分析大鼠到达可视平台的时间,后三天记录大鼠到达隐蔽的该平台的时间,即逃避潜伏期。第六天开始空间探索实验,撤掉平台,记录分析大鼠经过平台原始位置的次数,记录分析大鼠在平台所处象限的时间和路程,并以此计算时间和路程在总时间及总路程中所占的比率。4.中枢胰岛素信号通路分子的检测取大鼠海马及皮层,Western blot法分别分析IR、IGF-1R、PI3K、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylation of protein kinase B.p-AKT)及AKT等指标在不同组别中的表达差异,以此明确中枢胰岛素抵抗是否存在。5.组织病理学检测苏木素-伊红(HE)染色检测各组大鼠海马及皮层的组织形态学改变。6. AGEs/RAGE系统检测免疫组织化学法大鼠海马与皮层AGEs含量变化；荧光定量RT-PCR测定各组大鼠海马及皮层RAGE mRNA水平表达。7.氧化产物的检测采用组织活性氧荧光定量(DCFH-DA)方法检测各组大鼠海马及皮层内的活性氧(ROS)水平；采用丙二醛(MDA)测定法检测各组大鼠海马及皮层内的脂质过氧化(lipid peroxidation, LPO)水平；采用二硝基苯肼(DNPH)反应法检测蛋白羰基(protein carbonal content, PCC)含量。8.抗氧化保护系统的检测采用生化方法检测各组大鼠脑组织海马及皮层超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性或含量。9.神经炎症因子的检测采用酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测各组大鼠脑组织海马及皮层NF-κB, TNF-α和IL-1β的表达。10.过氧化物酶体增殖体激活受体(PPAR γ)的检测Western blot法检测各组大鼠脑组织海马及皮层PPARy蛋白水平表达。11.胆碱能系统活性检测：采用生化方法检测检测各组大鼠脑组织海马及皮层胆碱乙酰转移酶(AChE)和乙酰胆碱(ACh)的活性或含量变化。12.结果统计：运用SPSS 17.0进行数据统计分析,所有的结果都采用均数±标准差来表示,应用单因素方差分析(ANOVA)和Turkey检验分析组间差异,当有两个自变量进行比较时采用两因素方差进行统计学分析,P0.05表明差异具有统计学意义。研究结果1.胰岛素抵抗大鼠中枢胰岛素信号通路的改变及番茄红素的干预作用1.1番茄红素改善了胰岛素抵抗大鼠存在的胰岛素敏感性异常F组及F+LYCO组各有一只大鼠因死亡或疾病排除出实验。各组大鼠体重与空腹血糖无显著统计学差异,CNTL组空腹胰岛素水平为13.7±2.7mU/L,HOMA-IR为3.05±0.44。F组,即胰岛素抵抗组,空腹胰岛素水平为38.8±5.6mU/L(P0.01 vs正常对照组), HOMA-IR为9.12±0.6(P0.01 vs正常对照组)。F+LYCO组空腹胰岛素水平为19.1±4.5 mU/L(P0.01 vs正常对照组；P0.05 vs胰岛素抵抗组),HOMA-IR为4.19±0.33(P0.01 vs正常对照组；P0.05 vs胰岛素抵抗组)。CNTL组与LYCO组之间无显著统计学差异。1.2番茄红素改善了胰岛素抵抗大鼠中枢胰岛素信号通路蛋白IR、IGF-1R、 PI3K、p-AKT及AKT等指标表达的异常F组大鼠海马(P0.05)及皮层(P0.05)的IR、IGF-1R、PI3K及p-AKT的表达较CNTL组明显降低。F+LYCO组海马(P0.05)及皮层(P0.05)的IR、IGF-1R、PI3K及p-AKT的表达较F组明显增高,F+LYCO组海马(P0.05)及皮层(P0.05)的1R、IGF-1R、PI3K及p-AKT的表达仍低于CNTL组。CNTL组与LYCO组之间无显著统计学差异。AKT在各组表达无明显差异。2.番茄红素对胰岛素抵抗大鼠脑组织损伤的保护作用及机制研究2.1番茄红素改善了胰岛素抵抗大鼠学习和记忆能力的下降前五天的定向航行实验(分为2天的可视平台实验和3天的隐蔽平台实验)反应了大鼠学习能力,第六天空间探索实验反应了大鼠的记忆能力。在2天的可视平台实验中,各组的大鼠逃避潜伏期无显著统计学差异(P0.05)；在3天的隐蔽平台实验中,F组大鼠逃避潜伏期较CNTL组均明显延长(P0.05),F+LYCO组较F组的逃避潜伏期明显缩短(P0.05),CNTL组和LYCO组之间无明显差异。在空间探索实验中,F组大鼠经过该平台所在位置的次数较CNTL组显著减少(P0.01),F+LYCO组大鼠经过该平台的次数较F组明显增加(P0.01),CNTL组和LYCO组无明显统计学差异；F组大鼠寻找该平台所在位置所用的的路程和时间比例较CNTL组显著减少(P0.01,P0.01),F+LYCO组大鼠寻找该平台所在位置所用的的路程和时间比例较F组明显增加(P0.01,P0.01),CNTL组和LYCO组无明显统计学差异。2.2番茄红素可以改善胰岛素抵抗大鼠脑组织病理损伤在CNTL组和LYCO组,大鼠海马及皮层神经细胞排列整齐,数量较多,核仁较为明显；F组大鼠海马及皮层神经细胞数量减少,排列紊乱,出现细胞核浓缩现象；F+LYCO组的情况介于CNTL组和F组之间。2.3番茄红素对胰岛素抵抗大鼠脑组织损伤的保护机制研究2.3.1番茄红素可以下调胰岛素抵抗大鼠AGEs/RAGE系统的表达F组大鼠海马与皮层AGEs表达水平较CNTL组明显升高(P0.05),F+LYCO组大鼠海马与皮层AGEs表达水平较F组降低(P0.05),CNTL组和LYCO组之间无明显差异。F组大鼠海马(P0.05)及皮层(P0.05)RAGE mRNA水平较CNTL组明显升高,F+LYCO组大鼠海马(P0.05)及皮层(P0.05) RAGE mRNA水平较F组降低,F+LYCO组大鼠海马(P0.05)及皮层(P0.05)RAGE水平仍高于CNTL组,CNTL组和LYCO组之间无明显差异。2.3.2番茄红素降低胰岛素抵抗大鼠海马及皮层氧化产物的生成F组大鼠海马(P0.05,P0.01,P0.01)及皮层(P0.01,P0.01,P0.05)ROS、LPO和PCC水平较CNTL组明显升高,F+LYCO组大鼠海马(P0.05,P0.05,P0.05)及皮层(P0.05,P0.05,P0.01)ROS水平较F组降低,F+LYCO组大鼠海马(P0.05,P0.05,P0.05)及皮层(P0.05,P0.05,P0.05)ROS水平仍高于CNTL组,CNTL组和LYCO组之间无明显差异。2.3.3番茄红素提高胰岛素抵抗大鼠海马及皮层的抗氧化防御系统功能F组大鼠海马(P0.01,P0.05,P0.05)及皮层(P0.05,P0.01,P0.05)SOD、CAT和GPx活性较CNTL组明显降低,F+LYCO组大鼠海马(P0.01,P0.05,P0.05)及皮层(P0.05,P0.05,P0.01)CAT和GPx活性较F组升高,F+LYCO组大鼠海马(P0.01,P0.05,P0.05)及皮层(P0.05,P0.05,P0.01)SOD、CAT和GPx活性仍低于CNTL组,CNTL组和LYCO组之间无明显差异。F组大鼠海马(P0.05)及皮层(P0.05)GSH含量较CNTL组明显降低,F+LYCO组大鼠海马(P0.05)及皮层(P0.05)GSH含量较F组升高,F+LYCO组大鼠海马(P0.01)及皮层(P0.05)GSH含量仍低于CNTL组,CNTL组和LYCO组之间无明显差异。2.3.4番茄红素下调胰岛素抵抗大鼠海马及皮层炎症因子的表达F组大鼠海马(P0.05,P0.05,P0.01)及皮层(P0.05,P0.05,P0.01)的NF-κB、TNF-α口IL-1β水平明显高于CNTL组,F+LYCO组大鼠海马(P0.05,P0.05,P0.01)及皮层(P0.05,P0.01,P0.05)的NF-κB、 TNF-a和IL-1 β水平低于F组,F+LYCO组大鼠海马(P0.05,P0.05,P0.05)及皮层(P0.01,P0.05,P0.05)的NF-κB、TNF-α和IL-1 p水平高于CNTL组,CNTL组和LYCO组之间无明显差异。2.3.5番茄红素可以增强大鼠海马及皮层PPARγ蛋白表达F组大鼠海马(P0.05)及皮层(P0.05)PPARγ蛋白表达较CNTL组明显降低,F+LYCO组大鼠海马(P0.05)及皮层(P0.05)PPARy蛋白表达较F组升高,F+LYCO组大鼠海马(P0.01)及皮层(P0.05)PPARy蛋白表达仍低于CNTL组,CNTL组和LYCO组之间无明显差异。2.3.6番茄红素可以改善胰岛素抵抗大鼠海马及皮层胆碱能系统的活性F组大鼠海马(P0.05)及皮层(P0.01)AChE活性较CNTL组明显升高,F+LYCO组大鼠海马(P0.01)及皮层(P0.05)AChE活性表达较F组降低,F+LYCO组大鼠海马(P0.05)及皮层(P0.01)AChE活性仍低于CNTL组,CNTL组和LYCO组之间无明显差异。F组大鼠海马(P0.01)及皮层(P0.01)ACh含量较CNTL组明显降低,F+LYCO组大鼠海马(P0.05)及皮层(P0.05)ACh含量表达较F组升高,F+LYCO组大鼠海马(P0.05)及皮层(P0.05)ACh含量仍低于CNTL组,CNTL组和LYCO组之间无明显差异。研究结论1.果糖喂养诱导建立的外周胰岛素抵抗大鼠模型重复性及稳定性好,是胰岛素抵抗机制及干预研究较为理想的模型。番茄红素可以改善外周胰岛素抵抗。2.中枢胰岛素信号通路受损存在于胰岛素抵抗模型,番茄红素可以影响中枢胰岛素信号通路,改善中枢胰岛素抵抗。增强IR,IGF-1R,PI3K及PKB/AKT等指标表达可能是番茄红素保护胰岛素抵抗大鼠脑组织损伤的重要分子生物学机制之一。3.胰岛素抵抗大鼠认知功能下降,番茄红素治疗后可以部分逆转上述改变,提高胆碱能系统活性,改善了认知功能障碍。4.神经细胞数量减少、排列紊乱、细胞核浓缩现象,是胰岛素抵抗大鼠海马与皮层的病理表现,而番茄红素可以显著的减轻改善上述病理改变,提示了其明显神经保护作用。5.胰岛素抵抗大鼠海马与皮层中AGEs表达增加,与之伴随的RAGE mRNA表达水平增加。番茄红素治疗后海马与皮层中AGEs表达减少,RAGE mRNA水平显著下降。6.胰岛素抵抗大鼠海马与皮层中氧化产物含量明显增高,而抗氧化系统活性降低。给予番茄红素治疗后氧化产物含量明显降低,抗氧化作用显著升高,表明了番茄红素的抗氧化作用。7.胰岛素抵抗大鼠海马与皮层中NF-κB、TNF-α和IL-1β显著升高,番茄红素治疗后可以显著降低各炎症因子水平,抑制炎症反应。8.胰岛素抵抗大鼠海马与皮层中PPARγ表达下降,提示PPARγ可能是胰岛素抵抗脑组织损伤及AD的有效治疗靶点。番茄红素治疗后可以显著升高PPARγ表达水平。总之,番茄红素具有多效性的“霰弹”特点,或可作为预防和治疗AD等中枢神经退行性疾病的药物。研究意义与本课题组以往进行的有关胰岛素抵抗的研究相比,该实验有助于进一步了解胰岛素抵抗对中枢胰岛素信号通路的影响,进而从AGEs/RAGE系统、氧化应激、炎症反应、PPARγ改变及胆碱能系统活性等几方面,探索胰岛素抵抗大鼠认知功能障碍的机制,明确其与AD的相关性,为AD等神经退行疾病的防治提供新的干预靶点。同时充分研究番茄红素多效性特点,为番茄红素临床预防和治疗记忆减退提供了理论依据和现实价值。
【关键词】：番茄红素 胰岛素抵抗 氧化损伤 神经炎症反应 认知障碍
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 中文摘要6-15
• 英文摘要15-27
• 符号说明27-29
• 前言29-32
• 第一部分 胰岛素抵抗大鼠中枢胰岛素信号通路改变以及番茄红素的干预作用32-47
• 材料与方法32-40
• 结果40-41
• 讨论41-44
• 结论44
• 附图表44-47
• 第二部分 番茄红素对胰岛素抵抗大鼠脑组织损伤的保护作用及机制研究47-84
• 材料与方法47-66
• 结果66-69
• 讨论69-75
• 结论75-76
• 附图表76-84
• 参考文献84-94
• 综述94-104
• 参考文献99-104
• 致谢104-105
• 攻读博士学位研究生期间的学术成果105-106
• 外文论文Ⅰ106-134
• 外文论文Ⅱ134-163
• 附件163

【参考文献】

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1 李焱;;中枢胰岛素抵抗与阿尔茨海默病发病关系的认识[J];诊断学理论与实践;2009年03期

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本文编号：1044286