氟喹诺酮类药物诱导铜绿假单胞菌耐药性及分子机制的研究

发布时间：2017-10-16 20:45

本文关键词：氟喹诺酮类药物诱导铜绿假单胞菌耐药性及分子机制的研究

【摘要】：研究背景:细菌耐药性是当今世界所面临的紧迫公共卫生问题之一,抗菌药物的大量应用是导致细菌耐药性逐年增加的主要因素。WHO的调查显示,耐药细菌几乎分布于全球的各个地区,2015年3月27日美国公布抗击耐药细菌国家行动计划。本文所研究的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA),是近年来心内科植入手术(支架、起搏器)患者术后感染的主要病原菌。假单胞菌属的代表菌株就是PA,是一种条件致病菌,在人的呼吸道、肠道、和皮肤等都有该菌存在,易导致医院感染的发生。近年来我国卫生部细菌耐药监测报告显示,铜绿假单胞菌排名处于院内感染病原菌的前四位,在呼吸道分离的病原菌中,铜绿假单胞菌位居首位。近年来由于广谱抗菌药物的大量使用,致使PA对国内常用抗菌药物的敏感性逐年下降,多重耐药和泛耐药PA的分离率日渐增高,成为院内严重的化脓性感染,尤其是败血症、肺脓肿、慢性支气管炎、内植物手术(心脏介入手术、人工关节植入手术)后引起感染等重要的致病菌,由于PA耐药机制复杂,治愈其引起的感染对临床医生来说是一个巨大的挑战。近20年来抗菌药物喹诺酮类的发展十分迅速,由于该类药物的剂型多、使用方便、抗菌活性强、抗菌谱广等优点,常常被国内外临床医生用于控制由病原体引起的感染性疾病中。因此,细菌对喹诺酮类药物的敏感性呈下降趋势,对该类抗菌药物耐药病原菌的种类不断增多。研究证实PA对喹诺酮类药物敏感性下降的主要机制为:拓扑异构酶Ⅱ,Ⅳ基因突变;主动外排系统的调控基因高表达而致细菌主动外排能力增强;生物膜的形成和细菌外膜通透性改变。几种耐药机制单独或共同作用引起PA对喹诺酮药物的耐药性增加。但是,PA对喹诺酮类药物耐药性与喹诺酮类药物使用时间、剂量之间的相关性、耐喹诺酮药物PA的耐药特点以及临床在应用喹诺酮药物的周期内对喹诺酮药物敏感的PA对其耐药机制的变化尚不十分清楚。目的:深入了解我院内科系统PA感染情况和对喹诺酮药物耐药性流行状况,提供可经验用于本地区PA感染的抗菌药物。研究PA对喹诺酮药物耐药性与喹诺酮类药物使用剂量和使用周期之间的相关性、耐喹诺酮药物PA的耐药特点和具体机制,以及临床在应用喹诺酮药物的周期内对喹诺酮药物敏感的PA产生耐药机制的变化,为临床推荐适合喹诺酮药物治疗PA感染的药物剂量和使用周期,对预防和控制医院感染给予指导。方法:1.所有病原菌的原始数据输入WHONET5.4软件,使用该软件统计PA的标本分布和耐药率;各种药物的DDD值来源于卫生部抗菌药物临床应用监测网药品字典,DDDs=某抗菌药年消耗量(m)/该药的DDD值,本研究抗菌药物的使用频度(DBD)用DDDs/100bed-days表示;研究抗菌药物使用与其耐药性间的关系使用斯皮尔曼相关性的统计学方法。分析不同标本中分离出的PA对常用抗菌药物耐药率之间的差异,使用ANOVA中的LSD(最小显著差异法)。2.使用琼脂稀释法测定MIC值;PCR扩增拓扑异构酶基因(gyr A、gyr B、par C和par E),纯化,测序;通过RT-PCR分析4种外排系统膜连接蛋白Mex A、Mex C、Mex E和Mex X表达量;使用χ2检验分析基因突变和外排泵表达与耐药性之间的关系。3.采用CIP、LEV和NOR的梯度浓度(0.5MIC、1MIC、2MIC和4MIC)MH肉汤与临床分离的7株铜绿假单胞菌分别进行体外培养;采用E-test法和琼脂稀释法测定诱导后菌株的MIC值;PCR扩增Ⅱ型拓扑异构酶基因,纯化,测序;RT-PCR分析4种外排系统膜连接蛋白Mex A、Mex C、Mex E和Mex X基因的表达量;使用统计学软件SPSS16.0,对诱导前与诱导后MIC值的比较采用t检验,检验水准a=0.05,p0.05为差异有统计学意义。采用单因素方差分析(LSD),检验三种不同浓度梯度抗菌药物诱导后,铜绿假单胞菌MIC值的差别。以p0.05作为差异有统计学意义。4.采用结晶紫染色和激光共聚焦显微镜技术研究在体外与三种喹诺酮药物不同浓度(0.5MIC、1MIC、2MIC和4MIC)诱导后铜绿假单胞菌生成生物膜能力的差别,采用单因素方差分析PA与三种不同浓度梯度抗菌药物诱导后生物膜形成能力的差别。以p0.05作为差异有统计学意义。结果:1.我院PA在内科患者中主要以呼吸道感染为主,占55.2%,呼吸道感染的PA对抗菌药物耐药率高于其它部位感染的该菌,且有统计学差异,p0.05;九年间医院PA对阿米卡星的耐药率最低,2010年为6.3%;对头孢他啶的耐药率均保持在30%以下,其次为环丙沙星;但总体对所监测其它抗菌药物的敏感性较低。相关性分析发现喹诺酮类药物(左氧氟沙星、环丙沙星)和碳青霉烯类药物(亚胺培南、美罗培南)的用量与PA对其的耐药率呈正相关,p≤0.05。2.临床呼吸道分离的150株PA,对环丙沙星的耐药率最低为28.8%,对莫西沙星的耐药率最为严重,耐药率为96.3%,对左氧氟沙星和氧氟沙星次之,所分离菌株中有38株PA同时对所研究5种氟喹诺酮药物均耐药。3.38株对氟喹诺酮药物耐药PA中26株存在gyr A亚单位Thr83→Ile突变,3株有par C亚单位Ser80(TCG)-Ieu(TTG)突变,4株由于par C亚单位38位碱基的缺失,导致氨基酸的连续突变,未发现gry B和par E基因QRDR区的突变株;gyr A基因突变组与未突变组对CIP(p0.05),LEV(p0.001)的敏感性有统计学意义,而对NOR(p0.05)的敏感性无统计学意义。4.通过比较在加入和不加外排泵抑制剂PAβN两种处理条件测得的MIC值,筛选出外排泵高表达表型阳性的菌株共9株,阳性率为23.7%(9/38);RT-PCR扩增后,有6株PA外排基因mex A高表达。外排基因Mex E高表达的菌株有2株。未发现存在高表达外排基因Mex C和Mex X的菌株。5.7株PA与CIP、LEV和NOR不同浓度(0.5MIC、1MIC、2MIC、4MIC)共同培养后,PA对CIP的MIC值的变化是原菌株的2.5-160倍,对NOR的MIC值的变化是原菌株的4-32倍,对LEV的MIC的变化是原菌株的1-64倍;LSD统计分析,药物浓度为4MIC时对三种氟喹诺酮类药物MIC值影响与0.5MIC、1MIC和2MIC有差异,p0.05。NOR和LEV在药物浓度为2MIC和4MIC时对诱导菌株MIC值有差异,有统计学意义p0.05;CIP与LEV和NOR之间无统计学意义p0.05。6.三种氟喹诺酮药物不同浓度诱导后PA,经PCR扩增,将其产物纯化后的测序,其结果与Gen Bank中PAO1的相应序列进行比对,在Gry A亚单位的突变主要为83Thr-Gla(10株),72Asp-Gly(3株),87Asp-Asn(1株);4株有par C基因QRDR区发生80位氨基酸密码子发生突变Ser80(TCG)-Ieu(TTG);未发现在Gry A和Par C的QRDR的其它突变;外排基因Mex C高表达的菌株占所有研究菌株的98.8%,其次为Mex X高表达的菌株45.23%,Mex E高表达的菌株为26.19%。未发现有Mex A的高表达株。7.结晶紫染色后,使用SM-Mk3酶标仪在570nm单波长下测吸光值。在所测菌株中A5700.3占39.29%;0.3A5701.0占48.21%;A5701.0占12.50%;差异性分析药物对不同菌株生物膜生成量之间(F=2.202,p=0.116),提示不同氟喹诺酮类药物之间对临床分离7株铜绿假单胞菌生物膜的生成无统计学意义p0.05;差异性分析不同浓度之间的氟喹诺酮药物对生物膜生成能力有显著差异(p=0.000)。使用最小显著差数法(LSD)分析,0.5MIC诱导后的临床分离株对生物膜生成能力的影响与1MIC、2MIC和4MIC诱导后的菌株有显著差异p=0.000,而其余三个浓度之间无统计学意义p0.05。8.对实验菌株PA生物膜的观察分别在24h、48h、72h并采集图像,未经药物诱导的对照菌株生物膜形成在相同的观察时间点上晚于经过药物诱导的菌株,在72h镜下可见菌株仍疏松,经过LEV诱导的菌株在24h菌落已聚集成较大的片状生物膜,形成速度要高于CIP诱导的菌株。0.5MIC诱导后的菌株形成生物膜明显强于4MIC诱导后的菌株。结论:1.PA耐药率变化与氟喹诺酮药物、碳氢霉烯类药物使用量的增加成正相关;阿米卡星,头孢他啶、环丙沙星可作为治疗PA的经验用药;2.氟喹诺酮药物耐药的PA以Gyr A亚单位Thr83(ACC)→Ile(ATC)突变和外排基因mex A高表达为主;本研究在国内首次发现par C亚单位38位碱基的缺失,使相应氨基酸的错译,导致PA对喹诺酮的耐药;3.敏感的PA可在接触抗菌药物后产生耐药性,外排基因Par C的高表达是其产生耐药的主要机制;4.浓度为4MIC的氟喹诺酮药物的使用,易造成多重耐药的PA的形成;浓度为0.5MIC的氟喹诺酮类药物诱导生物膜生成能力强;5.推荐在治疗敏感的PA引起的中重度感染时,合用泵抑制剂会延缓PA耐药的产生,应足量短疗程治疗,减少突变株的产生。
【关键词】：铜绿假单胞菌 氟喹诺酮药物 Ⅱ类拓扑异构酶 外排泵 生物膜
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.5
【目录】：

中文摘要8-13
英文摘要13-20
常用缩写词中英文对照表20-21
前言21-24
第一部分 2002-2010 年医院内科系统分离铜绿假单胞菌耐药性与抗菌药物的使用的相关性研究24-37
引言24
1 材料与方法24-27
1.1 材料24-25
1.2 方法25-27
2 结果27-34
2.1 铜绿假单胞菌的构成比27-28
2.2 常用抗菌药物的使用量28-29
2.3 铜绿假单胞菌的耐药率29-30
2.4 使用量与耐药率相关性研究结果30-31
2.5 四类抗菌药物的使用与耐药性的关系31-34
3 讨论34-36
4 结论36-37
第二部分临床分离铜绿假单胞菌耐氟喹诺酮药物分子机制的研究37-71
引言37-39
第一节临床分离铜绿假单胞菌Ⅱ类拓扑异构酶基因突变与耐药性的关系39-55
1 材料与方法39-45
1.1 材料39-40
1.2 方法40-45
2 结果45-52
2.1 5 种氟喹诺酮的耐药率45
2.2 PCR扩增产物电泳图45-48
2.3 基因测序结果48-51
2.4 统计学分析结果51-52
3 讨论52-54
4 结论54-55
第二节临床分离铜绿假单胞菌4种外排泵高表达的分布与耐药性关系的研究55-71
1 材料和方法55-60
1.1 材料55-56
1.2 方法56-60
2 结果60-68
2.1 主动外排泵外排表型阳性菌的筛选结果60-62
2.2 RNA含量与蛋白质含量吸光度的比值62-63
2.3 外排泵基因检测63-64
2.4 PCR扩增曲线图64-68
3 讨论68-70
4 结论70-71
第三部分氟喹诺酮类药物诱导铜绿假单胞菌耐药性及分子机制的研究71-93
引言71-72
第一节不同浓度氟喹诺酮药物体外诱导铜绿假单胞菌耐药性的研究72-84
1 材料与方法72-76
1.1 材料72-73
1.2 方法73-76
2 结果76-82
2.1 MIC检测结果76-77
2.2 诱导浓度确定77
2.3 诱导耐药77-78
2.4 诱导前后抗菌药物敏感性测定78-82
3 讨论82-83
4 结论83-84
第二节氟喹诺酮药物体外诱导临床分离铜绿假单胞菌基因突变和外排泵的研究 . 6484-93
1 材料与方法84-86
1.1 材料84-85
1.2 方法85-86
2 结果86-90
2.1 耐药基因检测结果86
2.2 PCR产物扩增86-87
2.3 诱导后菌株基因测序结果87
2.4 诱导后外排泵基因的表达87-90
3 讨论90-92
4 结论92-93
第四部分不同浓度氟喹诺酮药物诱导铜绿假单胞菌生物膜形成的研究93-114
引言93-94
第一节铜绿假单胞菌临床生物膜形成的检测94-104
1 材料和方法94-97
1.1 材料94-95
1.2 方法95-97
2 结果97-101
2.1 生物膜吸光度的测定97
2.2 生物膜生成能力的比较97
2.3 诱导后菌株生物膜形成能力比较97-101
3 讨论101-103
4 结论103-104
第二节激光共聚焦显微镜观察诱导耐药后铜绿假单胞菌生物膜的形成104-114
1 材料与方法104-107
1.1 材料104-105
1.2 方法105-107
2 结果107-111
2.1 生物膜图像的采集107
2.2 预实验结果107-108
2.3 生物膜形成图像108-111
3 讨论111-113
4 结论113-114
参考文献114-126
综述126-143
参考文献136-143
致谢143-144
在学期间承担/参与的科研课题与研究成果144-145
个人简历145

【参考文献】

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