硫氧还蛋白-1抵抗环境应答中肾上腺素损伤的分子机理

发布时间：2017-10-26 16:21

  本文关键词：硫氧还蛋白-1抵抗环境应答中肾上腺素损伤的分子机理

  更多相关文章： 肾上腺素应激 DNA损伤 硫氧还蛋白-1 β-抑制蛋白-1

【摘要】：机体通过活化交感神经系统和分泌儿茶酚胺肾上腺素与去甲肾上腺素来对抗环境中的有害刺激。这些荷尔蒙可以直接与细胞表面的G蛋白偶联肾上腺素能受体相结合,继而产生一系列应答反应,并对生物体产生更持久的影响。应激反应通常是瞬时的,它可以导致免疫抑制、生长抑制以及分解代谢的增强。流行病学的研究表明慢性应激反应则可导致DNA的损伤和各种疾病,例如衰老、肿瘤形成、流产和神经精神疾病、消化性溃疡、心血管紊乱等。肾上腺素和去甲肾上腺素可以促进细胞内氧化应激,氧化应激可以进一步导致促癌基因的活化、肿瘤抑制基因的失活、DNA损伤和基因组的不稳定性,例如,儿茶酚胺则可以通过羟基自由基的产生导致DNA的损伤。然而,应激产生的负面效应的机制尚不清楚。肾上腺素(epinephrine, EPI)是一种儿茶酚胺应激荷尔蒙,由肾上腺髓质分泌。肾上腺素的水平受到心理应激的调控,主要是通过调节其生物合成酶苯乙醇胺N-甲基转移酶(phenylethanolamine N-methyltransferase, PNMT)来实现的。早期生长反应基因-1(Early Growth Response protein-1, EGR-1)和特异蛋白1(specificity protein, Spl)是PNMT转录激活子,通过诱导肾上腺髓质中PNMT基因的表达对抗低氧应激。应激荷尔蒙可以调节很多重要的生理功能和疾病状态。此外,研究表明在心理应激条件下促进了肾上腺素的释放,因此本论文采用肾上腺素来构建细胞和小鼠的慢性应激模型。硫氧还蛋白-1(Thioredoxin-1, Trx-1)是一个小分子量的氧化还原调节蛋白,在维持细胞的氧化还原状态中起重要作用。氧化态的硫氧还蛋白包含一个二硫键,它可以被NADPH依赖的硫氧还蛋白还原酶所还原,进而起到抗氧化的功能。研究表明Trx-1可以清除氧和羟基自由基。Trx-1还可以保护细胞免受过氧化氢、紫外线的照射细胞损伤以及缺血再灌注引起的脑损伤。Trx-1转基因小鼠与野生型小鼠相比,其寿命延长30%,且Trx-1转基因小鼠可以抵抗糖尿病及环境因素引发的毒性。多种应激物均能诱导Trx-1的表达,包括病毒感染、X-射线、γ-射线、过氧化氢和炎症等。这些研究表明Trx-1在细胞损伤和对抗应激过程中具有保护效应,然而Trx-1是否参与了慢性肾上腺素应激及其分子机制尚不清楚。本论文的主要目的是探索Trx-1和慢性肾上腺素应激之间的相互关系以及Trx-1调节肾上腺素应激的分子机制。本论文的主要研究结果如下：(1)肾上腺素诱导DNA损伤的累积。用0,1,5和10μM的肾上腺素刺激PC12细胞24 h或每天给小鼠灌注0.2 mg/kg的肾上腺素2周后,Western Blot方法检测γ-H2AX(DNA损伤的早期标志)的表达变化；用10μM的肾上腺素刺激PC12细胞24 h,免疫荧光方法观察细胞内γ-H2AX的表达。结果显示肾上腺素显著增加了γ-H2AX的表达水平,并在荧光显微镜下观察到γ-H2AX荧光点的形成,表明慢性肾上腺素的处理可以引起DNA损伤。用p-肾上腺素能受体抑制剂propranolol、腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536和蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)的抑制剂H-89预刺激PC12细胞30 min,再用肾上腺素刺激24 h,结果显示肾上腺素引起的γ-H2AX表达的增加分别被propranolo、SQ22536和H-89所抑制,表明肾上腺素引起的DNA损伤通过p-肾上腺素能受体/cAMP/PKA信号通路。本论文还检测了肾上腺素对DNA损伤修复分子表达的影响。结果显示慢性肾上腺素处理后引起p53和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)表达的下降,表明慢性肾上腺素的处理可以导致DNA损伤修复分子表达的下降,进而导致了DNA损伤的累积。(2)Trx-1参与肾上腺素应激。Trx-1可以被多种应激诱导,但是Trx-1是否参与了肾上腺素应激尚未报道。用0,1,5和10 μM的肾上腺素刺激PC12细胞24 h或每天给小鼠灌注0.2 mg/kg的肾上腺素2周后,Western Blot方法检测Trx-1的表达变化,结果显示慢性肾上腺素刺激可以显著增加Trx-1的表达。本论文进一步检测了肾上腺素诱导Trx-1表达的信号通路,分别用propranolol,SQ22536和H-89预刺激PC12细胞30 min,再用肾上腺素刺激24 h。结果显示肾上腺素诱导Trx-1表达可以被propranolol、SQ22536和H89抑制,表明肾上腺素通过β-肾上腺素能受体/cAMP/PKA信号通路诱导Trx-1表达。(3)Trx-1对肾上腺素应激的调节作用。为了阐明Trx-1是否在慢性肾上腺素应激中起重要作用,将PC12细胞中Trx-1高表达或低表达,Western Blot方法检测γ-H2AX和p53的表达变化。结果显示Trx-1表达下调加剧了肾上腺素引起的的γ-H2AX表达的增加及p53水平的降低,表明Trx-1低表达加重了肾上腺素诱导的DNA损伤的累积。相反,Trx-1高表达抑制了肾上腺素诱导的γ-H2AX增加并回复了p53水平的下降,表明高表达Trx-1抑制了肾上腺素诱导的DNA损伤的累积。本论文进一步在小鼠水平上,研究Trx-1高表达对肾上腺素应激的影响。野生型肾上腺素组小鼠和人Trx-1转基因肾上腺素组小鼠每天灌注0.2 mg/kg的肾上腺素2周,对照组野生型小鼠和人Trx-1转基因小鼠则给予等体积生理盐水。Western Blot方法检测海马、皮层和胸腺(主要应对应激的器官)中γ-H2AX、p53、 CHOP和细胞周期素Cyclin D1的表达变化；ELISA方法检测丙二醛(malondialdehyde, MDA)(氧化应激的标志)含量的变化。与细胞结果一致的是,转基因小鼠高表达Trx-1抑制了肾上腺素诱导的γ-H2AX增加并回复了p53和CHOP的降低。此外,转基因小鼠高表达Trx-1还抑制了肾上腺素诱导的Cyclin D1增加和MDA含量的增加,表明Trx-1在慢性肾上腺素应激中起保护作用,这一作用可能与其抗氧化作用密切相关。(4)Trx-1对β-arrestin-1的调节作用。本论文进一步研究了Trx-1调节慢性肾上腺素应激的分子机制。除了氧化应激能够引起DNA损伤以外,β-arrestin-1也是调节DNA损伤的一个关键分子,因此本论文研究了肾上腺素对β-arrestin-1表达的影响。结果显示肾上腺素通过p-肾上腺素能受体/cAMP/PKA信号通路诱导β-arrestin-1的表达,并进一步检测了β-arrestin-1对肾上腺素引起DNA损伤的影响。结果显示下调β-arrestin-1的表达抑制了肾上腺素诱导的γ-H2AX和cyclinD1的表达、PC12细胞活力的增加、并回复了p53水平的下降,表明β-arrestin-1低表达抑制了肾上腺素应激诱导的DNA损伤,及细胞内对DNA损伤的应答,因此β-arrestin-1是肾上腺素诱导DNA损伤累积的一个关键蛋白。Trx-1和β-arrestin-1都参与了肾上腺素应激过程,因此本论文探讨了Trx-1和β-arrestin-1之间的相互关系,将Trx-1高表达或低表达后,Western Blot方法检测β-arrestin-1的表达变化,结果显示Trx-1可以负调节β-arrestin-1的表达。鉴于此,本论文研究了Trx-1与β-arrestin-1是否能够相互结合。首先检测了Trx-1与β-arrestin-1在细胞核与细胞质中的相对分布,Western Blot结果显示,Trx-1和β-arrestin-1在细胞核中的表达均增加。免疫共沉淀结果显示,在PC12细胞中,Trx-1与β-arrestin-1具有内源性的相互结合,且在肾上腺素作用后,Trx-1与β-arrestin-1之间的相互作用增强,表明Trx-1通过与β-arrestin-1相互结合进而负调控β-arrestin-1的表达。本论文系统地在体内和体外研究了Trx-1和慢性肾上腺素应激之间的相互关系以及Trx-1调节肾上腺素应激的分子机制。从实验结果得出结论：肾上腺素通过p-肾上腺素能受体/cAMP/PKA信号通路诱导Trx-1和β-arrestin-1表达,在肾上腺素应激过程中Trx-1通过调节β-arrestin-1的表达,抑制了肾上腺素引起的DNA损伤,从而发挥保护作用。
【关键词】：肾上腺素应激 DNA损伤 硫氧还蛋白-1 β-抑制蛋白-1
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要6-10
• Abstract10-15
• 缩写词索引15-27
• 第一章 绪论27-51
• 1.1 应激反应27-30
• 1.1.1 简介27
• 1.1.2 急性应激27-28
• 1.1.3 慢性应激28-30
• 1.2 肾上腺素30-40
• 1.2.1 简介30
• 1.2.2 肾上腺素能受体30-31
• 1.2.3 肾上腺素的药理作用及其作用机制31-32
• 1.2.4 肾上腺素的合成和代谢32-34
• 1.2.5 肾上腺素应激和DNA损伤34-40
• 1.3 硫氧还蛋白40-49
• 1.3.1 硫氧还蛋白的发现40
• 1.3.2 硫氧还蛋白的分类40
• 1.3.3 硫氧还蛋白的结构40-41
• 1.3.4 硫氧还蛋白系统41-42
• 1.3.5 硫氧还蛋白的功能42-47
• 1.3.6 硫氧还蛋白与疾病47-49
• 1.4 本论文的研究目的、意义和方案49-51
• 第二章 肾上腺素诱导DNA损伤通路及对相关分子表达的影响51-76
• 2.1 引言51
• 2.2 实验方案51-52
• 2.3 材料52-53
• 2.3.1 实验药物52
• 2.3.2 实验细胞株52-53
• 2.3.3 实验动物53
• 2.3.4 Alzet迷你渗透泵53
• 2.4 实验试剂53-55
• 2.5 实验试剂配制55-59
• 2.6 主要实验仪器设备59-60
• 2.7 实验方法60-65
• 2.7.1 细胞总蛋白的提取60-61
• 2.7.2 渗透泵灌装及包埋61
• 2.7.3 小鼠组织总蛋白的提取61
• 2.7.4 蛋白免疫印迹(Western Blot)61-64
• 2.7.5 FITC细胞免疫荧光64-65
• 2.7.6 统计学分析65
• 2.8 结果与分析65-73
• 2.8.1 肾上腺素诱导DNA损伤65-67
• 2.8.2 肾上腺素诱导DNA损伤的通路67-69
• 2.8.3 肾上腺素降低DNA损伤相关修复分子的表达69-73
• 2.9 小结与讨论73-76
• 第三章 硫氧还蛋白参与肾上腺素应激76-82
• 3.1 引言76
• 3.2 实验方案76
• 3.3 实验方法76
• 3.4 结果与分析76-80
• 3.4.1 肾上腺素诱导Trx-1表达77-78
• 3.4.2 肾上腺素诱导Trx-1的信号通路78-80
• 3.5 小结与讨论80-82
• 第四章 硫氧还蛋白对肾上腺素应激的调节作用82-99
• 4.1 引言82
• 4.2 实验方案82-83
• 4.3 材料和方法83-86
• 4.3.1 实验材料83
• 4.3.2 实验方法83-86
• 4.4 结果与分析86-97
• 4.4.1 Trx-1低表达加重肾上腺素应激诱导的DNA损伤86-88
• 4.4.2 Trx-1低表达进一步降低p53的水平88
• 4.4.3 Trx-1高表达回复肾上腺素应激诱导的DNA损伤88-91
• 4.4.4 Trx-1高表达抑制肾上腺素引起的p53和CHOP的降低91-94
• 4.4.5 Trx-1高表达抑制肾上腺素引起的Cyclin D1的增加94-95
• 4.4.6 Trx-1高表达抑制肾上腺素引起的MDA含量的增加95-97
• 4.5 小结与讨论97-99
• 第五章 硫氧还蛋白对β-arrestin-1的调节作用99-117
• 5.1 引言99
• 5.2 实验方案99-100
• 5.3 材料和方法100-104
• 5.3.1 实验材料100
• 5.3.2 实验方法100-104
• 5.4 结果与分析104-114
• 5.4.1 肾上腺素诱导β-arrestin-1的表达104-106
• 5.4.2 肾上腺素诱导β-arrestin-1表达的信号通路106-107
• 5.4.3 β-arrestin-1低表达回复肾上腺素应激诱导的DNA损伤及对p53的影响107-109
• 5.4.4 β-arrestin-1低表达抑制肾上腺素应激引起的PC12细胞活力的增加109-110
• 5.4.5 Trx-1负调节β-arrestin-1的表达110-112
• 5.4.6 Trx-1与β-arrestin-1之间的相互作用112-114
• 5.5 小结与讨论114-117
• 第六章 总结与展望117-121
• 6.1 总结117-119
• 6.2 展望119-121
• 致谢121-123
• 参考文献123-139
• 附录A139-140

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 赵璐;蒋爱梅;白洁;;以硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶为靶点的抗癌药物[J];生命的化学;2011年06期

2 梁鹏,张一娜,滕宗艳;硫氧还蛋白生物活性及其与人类疾病的关系[J];中国老年学杂志;2004年05期

3 张笑天;熊咏民;;硫氧还蛋白还原酶研究进展[J];国外医学(医学地理分册);2005年04期

4 陈燕;常立文;;线粒体型硫氧还蛋白的研究进展[J];实用儿科临床杂志;2009年02期

5 周佳;侯苹;白洁;;细胞外硫氧还蛋白的作用[J];中国老年学杂志;2010年22期

6 金鉴,周彦,胡晓燕,石宁,韩春雨,许彩民,强伯勤,袁建刚,彭小忠;人的类硫氧还蛋白还原酶活性的测定及其对细胞凋亡的影响[J];自然科学进展;2002年08期

7 施惠娟;王健;;睾丸/精子细胞特异表达的硫氧还蛋白研究进展[J];生殖与避孕;2006年04期

8 潘晓青;魏瑾;;硫氧还蛋白2的研究进展[J];医学综述;2012年05期

9 马芹芹;刘立亚;刘丹妮;李建平;王慧晔;黄秀兰;;心血管疾病中硫氧还蛋白相关的信号通路研究进展[J];中央民族大学学报(自然科学版);2012年02期

10 孙茂民,徐江英,夏春林,许琳;人脑硫氧还蛋白还原酶基因的克隆及测序[J];解剖学杂志;2003年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 刘晨临;黄晓航;Lee Yookyung;李光友;;日本凋毛藻Griffithsia japonica的硫氧还蛋白研究[A];中国海洋生化学术会议论文荟萃集[C];2005年

2 贾凌云;甄伟;王望;王宪;;钙网蛋白通过增加硫氧还蛋白减轻缺氧造成的肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤[A];中国生理学会第五届全国心血管、呼吸和肾脏生理学学术会议论文摘要汇编[C];2005年

3 沈恂;郑翌;刘光慧;刘振波;陈北冬;;硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶对基因表达和钙信号的调控作用[A];第六届全国自由基生物学与自由基医学学术会议和海峡两岸自由基生物学与自由基医学学术会议论文集[C];2004年

4 甘璐;刘琼;徐辉碧;朱玉山;杨祥良;;过量硒补充对谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶基因表达和活性的影响[A];第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集[C];2002年

5 戴波;肖定璋;林秋雄;郑猛;余细勇;;类硫氧还蛋白-2基因真核表达载体构建及其表达[A];2008第十一次全国临床药理学学术大会论文集[C];2008年

6 陈孝平;唐文心;胡胜;陈正望;;核内硫氧还蛋白与乳腺癌细胞MCF-7的凋亡正相关[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第八届第十七次学术年会论文汇编[C];2007年

7 张振义;包锐;俞江;周从照;陈宇星;;酿酒酵母胞质硫氧还蛋白还原酶(Trr1)的结构及功能[A];中国晶体学会第四届全国会员代表大会暨学术会议学术论文摘要集[C];2008年

8 唐文心;陈孝平;陈正望;;抗人硫氧还蛋白-1单克隆抗体的制备与鉴定[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第八届第十七次学术年会论文汇编[C];2007年

9 孙荷;谭国强;黄雪芳;丁焕根;吕建新;;硫氧还蛋白还原酶在基因敲除大肠杆菌中的克隆表达及体内外活性测定[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会论文集[C];2006年

10 高小博;马旭;陆彩玲;;丙烯酰胺对硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶活性的影响[A];中国毒理学会第六届全国毒理学大会论文摘要[C];2013年

中国博士学位论文全文数据库 前5条

1 贾金婧;硫氧还蛋白-1抵抗环境应答中肾上腺素损伤的分子机理[D];昆明理工大学;2015年

2 唐文心;硫氧还蛋白-1的生物学功能研究[D];华中科技大学;2009年

3 金擰;人的类硫氧化还原蛋白催化结构域的三维晶体结构及其功能的研究[D];中国协和医科大学;2002年

4 段东柱;以硫氧还蛋白还原酶为靶点的天然化合物抗肿瘤机制研究[D];兰州大学;2014年

5 张翠军;水稻质外体h型硫氧还蛋白OsTRXh1对水稻生长发育和胁迫反应的调节及其机制[D];河北师范大学;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 孔令聘;硫氧还蛋白-1抵抗甲基苯丙胺所致条件性位置偏好的作用及其分子机制[D];昆明理工大学;2015年

2 王晓慧;黑曲霉硫氧还蛋白体系基因的克隆、鉴定、融合及其在食品工程中的应用[D];浙江大学;2010年

3 向玲娟;硫氧还蛋白对同种异体移植炎症因子（AIF-1）的调控机理研究[D];武汉工程大学;2014年

4 王艳琦;硫氧还蛋白-1参与雌激素在过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡中的保护作用[D];广西医科大学;2013年

5 李奎;吗啡影响小鼠大脑内硫氧还蛋白表达的研究[D];昆明理工大学;2009年

6 朱勤俊;基于磁共振的硫氧还蛋白还原酶结构的表征[D];华中师范大学;2014年

7 周健康;吗啡调节硫氧还蛋白表达的分子途径[D];昆明理工大学;2014年

8 段莹亮;IL-10及吗啡对免疫细胞内硫氧还蛋白的调节[D];昆明理工大学;2009年

9 刘会敏;水稻核黄素合酶基因克隆、表达、亚细胞定位和烟草硫氧还蛋白NtTRXh功能研究[D];南京农业大学;2009年

10 余静;豌豆镁离子螯合酶Ⅰ亚基与硫氧还蛋白f的功能研究[D];华中农业大学;2011年

，

本文编号：1099475