不明原因复发性流产夫妇WNT6基因突变位点筛查及KIR2DL4基因多态性研究

发布时间：2017-10-29 05:03

  本文关键词：不明原因复发性流产夫妇WNT6基因突变位点筛查及KIR2DL4基因多态性研究

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【摘要】：研究背景复发性流产(Recurrent Miscarriage, RM)是指与同一性伴侣连续发生3次或3次以上的自然流产,不管既往有无活产史。发病率在1%-3%,其发病机制非常复杂,除染色体、解剖、内分泌、感染、免疫等已知的致病因素外,仍约一半原因不明。染色体异常一直被认为是复发性流产的主要发病因素之一,目前临床能够检测出的夫妇双方及胚胎组织染色体异常集中在染色体的结构和数目的异常,而在分子水平上的染色体异常仍然处于科研研究阶段,仍然属于不明原因复发性流产范畴。目前不明原因复发性流产分子遗传学水平的研究主要集中在血栓形成细胞因子、膜联蛋白基因多态性以及几种基因联合异常与不明原因复发性流产的关联性分析,结论也多不一致。子宫内膜的蜕膜化过程是近年不明原因复发性流产研究的新点。子宫内膜蜕膜化反应是正常妊娠建立和维持的关键环节之一,涉及基质细胞大量增殖、分化及凋亡,受复杂的分子信号网络调控。已有研究表明子宫内膜蜕膜化过程中Wnt蛋白的参与起到重要的作用。Wnt (wingless-type MMTV integration site family)基因家族,在物种间高度保守,以往的研究集中在调控胚胎期各器官的生长发育,与HOX家族协同调控女性苗勒氏管的正常发育与融合。目前的研究显示,Wnt家族通过Wnt- β-catenin信号通路,分泌Wnt蛋白,参与子宫内膜蜕膜化改变,Wnt-β-catenin信号通路失活可限制囊胚的植入与生长。WNT6是Wnt家族一员,基因序列在物种之间具有高保守性,最新研究显示,Wnt6在子宫内膜蜕膜化过程中起到必不可少的作用。通过研究小鼠子宫内膜间质细胞的培养观察发现,从胚胎着床后的第6天开始,Wnt6mRNA水平明显增加,原位杂交的结果显示,随着子宫内膜蜕膜化的进展,Wnt6蛋白在移植的第1-4天表达量很少,从第5天起囊胚周围的增生的子宫问质细胞上表达越来越多。对Wnt6基因敲除小鼠与野生型小鼠研究中发现,Wnt一’小鼠产出的幼仔的尺寸明显小于野生型小鼠,并且对移植第7天后的移植部位的内膜组织重量比较,明显比野生型小鼠轻：研究同时通过体外培养缺失WNT6基因的子宫间质细胞,发现细胞明显生长缓慢,生长周期延长,因此提出Wnt6与妊娠早期的子宫内膜蜕膜化进程相关。而关于WNT6基因与不明原因复发性流产的之间关系未见报道。因此本研究第一部分旨在中国汉族不明原因复发性流产患者夫妇中对WNT6基因进行突变位点筛查及功能预测。另一方面,母体的生殖免疫平衡调节也是不明原因复发性流产的研究重点和热点。很多的研究表明免疫平衡失衡,导致母体对胎儿的“免疫耐受”消失,激活母胎界面NK细胞,导致妊娠流产的发生。KIR2DL4属于免疫球蛋白样受体家族,是目前NK细胞受体研究领域的热点,它的结构复杂,具有激活性和抑制性受体的双重结构特点,并且研究也已经证实它与妊娠早期胎盘表面表达的HLA-G配体结合,发挥生物学效应。KIR2DL4广泛表达于所有NK细胞,且孕早期的子宫脱膜组织表达丰富。在对KIR2DL4分子结构的研究中发现其基因多态性与其功能活性密切相关。有研究者对复发性流产患者KIR2DL4的跨膜区域内含子6、外显子7基因型频率进行分析,其基因型频率与对照组分布明显不同,揭示了复发性流产患者该基因多态性与疾病的相关性。还有研究表明外显子7的10A(跨膜外显子编码区10个连续腺嘌呤结构)编码受体的全长,而9A外显子编码导致终止密码提前发生,同时在至少有一条10A的等位基因的受试者体内的少量CD56Bright NK细胞表面检测到KIR2DL4的表达,体外NK细胞培养研究证实,至少有一条10A的等位基因型能激活NK细胞,而9A纯合等位基因型不能激活NK细胞。那么对于KIR2DL4的基因多态性尤其是跨膜区域的10A/9A多态位点,与中国汉族人群不明原因复发性流产的关联性分析,值得在本研究的第二部分进行探讨分析。既往不明原因复发性流产患者的分子遗传学研究多集中筛查女性患者,忽略男性伴侣同时进行对照排除研究：另外,复发性流产的发病率低,因此病例收集困难,研究样本普遍偏小。本研究从临床样本库中严格筛选合格病例,扩大了病例数量,对病例组与对照组夫妇双方共同进行大规模的基因突变位点筛查及基因多态性的分析,探讨了WNT6基因和KIR2DL4基因与不明原因复发性流产的相关性。第一部分 WNT6基因在不明原因复发性流产夫妇基因突变位点的筛查研究目的通过对中国汉族100对不明原因复发性流产夫妇WNT6基因突变位点的筛查,探讨不明原因复发性流产是否与WNT6基因突变相关。研究方法利用PCR扩增及Sanger法基因测序技术,对中国汉族100对不明原因复发性流产夫妇和中国汉族100对正常生育夫妇行WNT6基因4个外显子的基因序列及相关侧翼序列检测。与Ensembl提供的正常序列比对,分析WNT6基因编码序列是否存在异常碱基改变、插入或缺失。若发现新的突变位点,则扩大对照组样本量,进一步验证突变位点是否只存在于病例组。后续应用多个在线软件预测突变位点对基因功能的影响。研究结果测序结果显示病例组4名女性患者WNT6基因各自筛查出4个新发突变位点： 1个位于内含子1与外显子1交界序列,属无义突变；2个位于外显子3编码序列,一个错义突变,一个同义突变；1个位于3’UTR区域,突变意义不详。病例组男性患者及对照组夫妇双方均未发现相同突变位点。位于该基因外显子3的错义突变为c.443T；G,该突变位于WNT1功能域,突变导致编码氨基酸改变,且两种氨基酸的化学结构和性质均不同,进一步的蛋白质模型预测表明其蛋白质的结构受到影响。扩大对照组女方样本量1倍,仍未发现相同的新发错义突变位点。所有样本均未检测到己知的SNPs位点。结论不明原因复发性流产女性患者WNT6基因错义突变可能是导致复发性流产的原因之一,为复发性流产的病因学研究补充新内容,在国际上未见相同报道,仍需要进一步的功能实验验证。第二部分KIR2DL4基因多态性与不明原因复发性流产的相关性研究研究目的 本研究对96对中国汉族不明原因复发性流产患者夫妇进行KIR2DL4基因多态性分析,探讨KIR2DL4基因多态性与不明原因复发性流产相关性。研究方法 以96对不明原因复发性流产夫妇和94对正常生育夫妇为研究对象,对KIR2DL4基因外显子3、外显子5、外显子7、外显子8和外显子9基因序列行PCR-SBT扩增测序,即采用两对引物,外显子3和5用一对引物,外显子7、8和9用一对引物,扩增产物经两步纯化后,用四对引物分别从上、下游测序,测序方法采用直接基因测序技术。分析基因在总人群中等位基因频率的发生率,以及外显子7的9A/10A多态位点等位基因频率在病例组和对照组的差异。研究结果 测序结果分析显示该研究中国汉族人群的基因型分布符合文献报道的中国人群的基因型分布。而位于跨膜区域第7外显子I0A/9A多态位点：基因型频率比较发现,本研究人群中总的基因型频率的比较无统计学差异；夫妇一方或夫妇双方的基因型频率在两组之间均无明显差异。等位基因型频率比较发现,该多态位点等位基因型频率在本研究人群中与中国汉族人群报道的等位基因型频率比较无统计学差异；两组中男方或夫妇双方的等位基因基因型频率无明显统计学差异。女方9A等位基因型频率(19.3%)高于对照组(14.9%),9A单倍体型在病例组有增高的趋势,但经过统计学分析,差异无显著性。结论 KIR2DL4基因多态性与不明原因复发性流产的发生无相关性。KIR2DL4等位基因型9A在不明原因复发性流产女性患者中有增高的趋势,需要进一步扩大样本研究证实。
【关键词】：WNT6 不明原因复发性流产 错义突变 基因突变 KIR2DL4 不明原因复发性流产 SNP NK细胞
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.21
【目录】：

• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 符号说明17-19
• 第一部分 WNT6基因在不明原因复发性流产夫妇基因突变位点的筛查19-41
• 前言19-21
• 材料与方法21-29
• 实验结果29-30
• 讨论30-33
• 结论33-34
• 附图附表34-36
• 参考文献36-41
• 第二部分 KIR2DL4基因多态性与不明原因复发性流产的相关性研究41-65
• 前言41-43
• 材料与方法43-50
• 实验结果50-53
• 讨论53-56
• 结论56-57
• 附图、附表57-59
• 参考文献59-65
• 综述65-83
• 参考文献74-83
• 致谢83-84
• 攻读博士学位期间撰写和发表的论文84-85
• 学位论文评阅及答辩情况表85-86
• 外文论文一86-92
• 外文论文二92-105

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 颜卫华;人类白细胞抗原与人类巨细胞病毒[J];免疫学杂志;2002年02期

2 颜卫华;NK细胞受体KIR2DL4的结构与功能[J];免疫学杂志;2003年S1期

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本文编号：1111488