白念珠菌甘露多糖疫苗评价及白念珠菌侵入人内皮和上皮细胞动态观察

发布时间：2017-10-30 10:18

  本文关键词：白念珠菌甘露多糖疫苗评价及白念珠菌侵入人内皮和上皮细胞动态观察

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【摘要】：白念珠菌是一种多边芽殖酵母菌,它是造成免疫缺陷人群医源性感染最主要的病原体之一。一般情况下,它是人类常见的寄生菌,可存在于口咽、胃肠道和阴道粘膜表面。正常情况下,它并不引起人类疾病。但是,当宿主局部微环境失调或粘膜屏障受损时,白念珠菌可造成粘膜感染,引起鹅口疮、霉菌性阴道炎、间擦疹等疾病。甚至在某些情况下,白念珠菌还可侵入粘膜上皮和血管内皮引起易感人群血行播散性感染。在引起上述疾病的过程中,白念珠菌与宿主细胞的相互作用贯穿始终。白念珠菌细胞壁是直接与宿主细胞接触的部分,含有大量可被机体识别的抗原。该菌细胞壁80-90%由糖类组成。细胞壁的最外层是甘露聚糖与胞壁蛋白共价结合而成的糖肽结构。既往研究发现,白念珠菌胞壁糖蛋白结构包含以α1,6键形成的甘露糖骨架和部分磷酸化的β-1,2键甘露聚糖为主的侧链。当用念珠菌胞壁甘露聚糖抗原复合物免疫小鼠后,可显著延长白念珠菌播散性感染模型小鼠的生存时间。但是,甘露聚糖为T细胞非依赖性2型抗原,缺乏有效的免疫原性,不能诱导机体产生足够的抗体。为了研发有效的抗真菌甘露聚糖疫苗,我们合成了钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin, KLH)与β-甘露二糖、三糖和四糖偶联形成的糖肽化合物。同时,通过软件设计,我们还从白念珠菌毒力蛋白Als1中截取特异性表位短肽,并将其与糖肽疫苗偶联,从而提供额外的抗原表位。Als1是白念珠菌胞壁蛋白,可以介导白念珠菌与血管内皮细胞粘附。我们将上述糖肽化合物以联合佐剂或不联合佐剂的形式免疫小鼠,末次免疫2周后采取小鼠血清,评价人工合成糖肽化合物的免疫原性和免疫反应性。研究发现,与KLH偶联的甘露聚糖糖肽疫苗可以刺激小鼠产生针对相应多糖的特异性抗体和针对Als1短肽的抗体。更有趣的是,与KLH偶联的甘露聚糖糖肽化合物可以在无佐剂的情况下使小鼠产生相应特异性抗体。但是,相比于甘露三糖和甘露二糖,甘露四糖糖肽疫苗并不能产生更高的抗体滴度。甘露三糖免疫的小鼠血清中的抗体可以识别白念珠菌的酵母和菌丝。同时,甘露三糖诱导产生的抗体还可识别热带念珠菌、光滑念珠菌和葡萄牙念珠菌四种临床常见的念珠菌,而甘露四糖和甘露二糖糖肽复合物刺激产生的抗体并不能识别这些念珠菌。除了β-(Man)3-KLH不联合佐剂的情况下可以对白念珠菌播散性感染模型产生保护性,其他疫苗联合/不联合佐剂并不能延长播散性念珠菌感染的小鼠生存时间。该实验说明只有甘露三糖糖肽疫苗产生的抗体可以识别并保护白念珠菌所致的感染,甘露聚糖糖链过长或过短都不能产生正确识别白念珠菌的抗体。白念珠菌侵入宿主非吞噬细胞,如上皮细胞和内皮细胞,在致病初期起至关重要的作用。目前尚缺乏白念珠菌与上述宿主细胞的动态观察研究。我们采用活细胞实时观测方法捕捉到白念珠菌与宿主细胞早期的相互作用过程。观察到宿主细胞伪足形成在介导内吞白念珠菌过程中起重要作用,依赖于白念珠菌菌丝特异蛋白Als3和宿主细胞骨架actin;而主动入侵则依赖白念珠菌菌丝生长。同时,我们观察了介导内吞和主动入侵在白念珠菌进入临床常见的2种人上皮细胞(OKF6/Tert2和FaDu)和2种人内皮细胞(HUVECs和TIME)的异同。介导内吞在白念珠菌进入FaDu细胞过程中起重要作用,但在其进入OKF6/Tert2上皮细胞过程中,两种途径均发挥重要作用。白念珠菌与]HUVECs内皮细胞相互作用早期,主要依靠介导内吞方式进入细胞,而在后期则以主要以主动入侵方式进入内皮细胞。白念珠菌进入TIME内皮细胞则主要依靠介导内吞作用。进入方式的差别可能与同种细胞不同细胞系的膜表面受体分布、信号通路以及细胞骨架(肌动蛋白和微管)有关。最后,我们还比较了白念珠菌毒力蛋白和宿主细胞因子在白念珠菌介导内吞和主动入侵过程中所发挥的作用。
【关键词】：白念珠菌 多糖 甘露聚糖 抗体 表皮细胞 上皮细胞
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 缩略词表11-13
• 前言13-20
• 一、课题背景介绍13-18
• 二、本研究的内容和意义18-20
• 第一部分：人工合成甘露聚糖糖肽疫苗免疫原性和免疫反应性测定20-39
• 一、引言20-21
• 二、材料与方法21-28
• 三、实验结果28-36
• 四、讨论36-39
• 第二部分：白念珠菌侵入内皮细胞与上皮细胞动态观察39-60
• 一、引言39-40
• 二、材料与方法40-50
• 三、实验结果50-58
• 四、讨论58-60
• 第三部分：白念珠菌侵入内皮细胞与上皮细胞的机制初探60-77
• 一、引言60
• 二、材料与方法60-63
• 三、实验方法63-66
• 四、实验结果66-74
• 五、讨论74-77
• 全文小结77-79
• 参考文献79-84
• 文献综述84-93
• 参考文献90-93
• 在读期间发表论文与科研工作说明93-94
• 致谢94

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本文编号：1117219